基于生物納米材料的蛋白激酶傳感與核酸定量研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)非常重要的一類化學(xué)修飾過程，它調(diào)控著幾乎整個生命過程。異常的磷酸化過程將導(dǎo)致許多炎癥和疾病如癌癥、糖尿病等。通過對蛋白激酶的研究能幫助對疾病的早期診斷以及找到治療疾病的潛在藥物靶點，因此實現(xiàn)蛋白激酶的靈敏檢測具有很重要的實際意義。常用的金屬納米材料，如磁納米顆粒，金納米顆粒等，由于具有高穩(wěn)定性，良好的生物相容性以及獨特的磁學(xué)、光學(xué)、電學(xué)性質(zhì)，在生命科學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用。核酸的定量研究對于傳染病毒分析、病原微生

2、物檢測、遺傳檢測等領(lǐng)域具有非常重要的意義。傳統(tǒng)的核酸定量分析方法都需要昂貴的儀器或者復(fù)雜的操作步驟，因此，開發(fā)簡單靈敏的核酸定量分析方法，具有很大的現(xiàn)實意義。熒光蛋白作為一種天然生物蛋白，由于自身的光學(xué)特性，以及通過人工改造后獲得的耐鹽、耐熱、表面超電荷等性質(zhì)，使其在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
　　 基于此，本論文利用生物納米材料獨特的光、電、磁學(xué)性質(zhì)，開發(fā)了兩種蛋白激酶和一種核酸定量的熒光檢測方法，具體工作如下:

3、　　 (1)基于鋯離子與磷酸基團的特異性結(jié)合，提出了一種新型的利用鋯離子表面修飾的磁性納米顆粒吸附帶熒光標記的磷酸化底物多肽來檢測激酶活性的熒光分析方法。在蛋白激酶A(Protein Kinase A，PKA)的底物多肽上標記FITC，多肽被磷酸化之后，與表面修飾鋯離子的磁性納米顆粒結(jié)合，通過磁性分離出上清液，溶液中的熒光變化反映了PKA的活性。該方法對PKA具有較低的檢測限(0.5 mUμL-1)，本方法同時成功應(yīng)用于PKA活性抑制

4、實驗(H-89，IC50=74.3 nM)及細胞裂解液中PKA活性的測定。
　　 (2)基于金納米顆粒能夠淬滅FITC熒光的原理，設(shè)計了通過磷酸化前后多肽帶電量的改變導(dǎo)致與金納米顆粒靜電吸附效果不同而產(chǎn)生不同熒光信號的傳感器。帶正電的金納米顆粒與磷酸化之后的底物多肽通過靜電吸附結(jié)合，導(dǎo)致多肽上標記的FITC熒光信號被金納米顆粒淬滅。該方法反應(yīng)時間短，操作簡單，信號靈敏，對PKA具有較低的檢測限(0.5 mUμL-1)，并且成功應(yīng)

5、用到抑制劑實驗中(H-89，IC50=55 nM)。
　　 (3)基于超正電荷綠色熒光蛋白(supercharged Green Fluorescent Protein，scGFP)帶正電荷和熒光的性質(zhì)，設(shè)計了等溫擴增產(chǎn)物競爭淬滅DNA的熒光傳感器以定量測定模板量。scGFP通過靜電吸附與帶有淬滅基團的短鏈DNA結(jié)合，scGFP的熒光被淬滅基團淬滅。加入擴增反應(yīng)體系后，長鏈擴增片段因為帶有更多負電荷而將短鏈淬滅DNA從scGFP