基于單核苷酸多態(tài)性的食品中大腸埃希氏菌溯源技術(shù).pdf

1、目前,食品安全問(wèn)題已成為我國(guó)繼人口、資源、環(huán)境之后的第四大社會(huì)問(wèn)題。在所有食品安全問(wèn)題中,由致病菌或條件致病菌的污染引起的食品安全事件又占有相當(dāng)大的比重。在這些致病菌中由致病性大腸埃希氏菌引起的食品安全問(wèn)題尤其值得人們關(guān)注。從肆虐全球30年可引起腹瀉、出血性腸炎等疾病的大腸埃希氏菌O157︰H7到近期出現(xiàn)在德國(guó)的大腸埃希氏菌O104︰H4疫情,所有這些由致病性大腸埃希氏菌引發(fā)的公共衛(wèi)生事件造成了嚴(yán)重的人員及財(cái)產(chǎn)損失并引發(fā)了全球的高度關(guān)注

2、。
　　因此,建立一種可以對(duì)不同地理來(lái)源的大腸埃希氏菌進(jìn)行有效追溯的方法將對(duì)于控制食源性感染、追溯食品中致病性大腸埃希氏菌來(lái)源將起到重要作用。目前,大腸埃希氏菌溯源研究主要集中在寄主溯源,并且多種分子生物學(xué)技術(shù)運(yùn)用于該領(lǐng)域的研究中。與其他分子溯源技術(shù)相比,MLST技術(shù)以其流程標(biāo)準(zhǔn)化,結(jié)果易于驗(yàn)證,重復(fù)性好,數(shù)據(jù)便于通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)共享等特點(diǎn)在多種細(xì)菌來(lái)源追溯研究中被廣泛使用。但是MLST技術(shù)依靠大量基因測(cè)序,不適用于大量樣本的溯源檢測(cè)。

3、
　　而SNP檢測(cè)技術(shù)使用簡(jiǎn)單、便捷、低成本的方法就可以獲得可靠結(jié)果。因此,基于大腸埃希氏菌持家基因SNP溯源分析技術(shù)逐漸成為新興熱點(diǎn)。但是SNP技術(shù)在大腸埃希氏菌地理來(lái)源追溯方面的研究仍是空白。
　　本研究首次將SNP技術(shù)應(yīng)用于大腸埃希氏菌的地理溯源研究。
　　本研究簡(jiǎn)述如下:
　　1.大腸埃希氏菌持家基因的選擇。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)合自行軟件計(jì)算基因多態(tài)性值,選擇大腸埃希氏菌四個(gè)持家基因clpX(caseinoly

4、tic peptidase X,酪蛋白水解蛋白酶X),fadD(acyl-CoA synthetase,?；o酶A合成酶),mdh(蘋(píng)果酸脫氫酶),uidA(beta-glucuronidase,葡萄糖苷酸酶)作為研究的目標(biāo)基因。
　　2.持家基因中多態(tài)性位點(diǎn)的篩選。以大腸埃希氏菌多位點(diǎn)序列分型數(shù)據(jù)庫(kù)(MLSTDatabase)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),采用生物學(xué)軟件Minimum SNPs計(jì)算四個(gè)持家基因中能夠反映位點(diǎn)分辨力的辛普森系數(shù)(即D

5、值)、選擇D值大于0.86并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及人工序列比對(duì)選擇候選位點(diǎn)。共獲得12個(gè)SNP位點(diǎn)。
　　3.不同地理來(lái)源大腸埃希氏菌菌株收集。從進(jìn)口生畜肉及加工食品及食品原料中分離大腸埃希氏菌菌株。生畜肉來(lái)自四大洲,12個(gè)國(guó)家和地區(qū):歐洲的丹麥(63株),德國(guó)(20株),愛(ài)爾蘭(17株),法國(guó)(17株),西班牙(25株);北美洲的美國(guó)(24株),加拿大(20株);大洋洲的澳大利亞(9株),新西蘭(3株);亞洲的印度(45株),中國(guó)(6株

6、)以及中國(guó)臺(tái)灣(4株)。共253株。菌株經(jīng)鑒定純化后使用。
　　4.通過(guò)測(cè)序,獲得每株菌持家基因上的SNP位點(diǎn)。具體步驟為:確定大腸埃希氏菌四個(gè)持家基因測(cè)序引物,對(duì)四個(gè)持家基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序,生物信息學(xué)方法對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行人工篩查分析,根據(jù)得到的多態(tài)性信息聚類(lèi)分析。253株大腸埃希氏菌被聚為61個(gè)SNP Groups。在9個(gè)SNP Groups,菌株表現(xiàn)出按大洲聚集的現(xiàn)象:SNP Group5,SNP Group19,S

7、NP Group39,SNP Group42,SNP Group43,SNP Group55中全部菌株來(lái)源于歐洲;SNP Group59中全部菌株來(lái)源于大洋洲;SNP Group52中全部菌株來(lái)源于北美洲;SNP Group22中全部菌株來(lái)源于亞洲。對(duì)于菌株數(shù)小于等于2株的SNPGroups,得到了35個(gè)地理特異性SNP標(biāo)記。其他SNPGroup中菌株來(lái)源于不同大洲或不同國(guó)家,說(shuō)明大腸埃希氏菌分離株具有豐富的遺傳多樣性。
　　5.

8、用10株隱藏來(lái)源的大腸埃希氏菌分離株進(jìn)行盲樣測(cè)試,以驗(yàn)證所得到的地理標(biāo)記。盲樣測(cè)試結(jié)果顯示:10株分離菌中,按照洲際溯源準(zhǔn)確率為80％;按照國(guó)家溯源準(zhǔn)確率為60%。
　　6.本研究嘗試應(yīng)用大腸埃希氏菌較保守的持家基因中的一定數(shù)量的SNP位點(diǎn)組合對(duì)大腸埃希氏菌地理來(lái)源進(jìn)行追溯,結(jié)果顯示SNP具備大腸埃希氏菌地理來(lái)源追溯的能力。
　　7.eBURST分析與SNP分析在分離株群體遺傳進(jìn)化方面具有相關(guān)性,與SNP分析相比eBURST