產(chǎn)柚苷酶的黑曲霉菌株的篩選、產(chǎn)酶特性及高產(chǎn)菌株選育的研究.pdf

1、柚皮苷是一種二氫黃酮類(lèi)化合物,是蕓香科植物,如葡萄柚、蜜柚、酸橙等的主要苦味物質(zhì)。柚類(lèi)果實(shí)中的柚皮苷含量在100ppm～370ppm之間,使得在制成果汁時(shí),讓消費(fèi)者難以接受,這嚴(yán)重影響了柚類(lèi)果汁行業(yè)的發(fā)展。柚皮苷的苦味脫除的方法主要有：吸附脫苦法、化學(xué)脫苦法、β-環(huán)糊精包埋法、酶法等。其中,利用微生物產(chǎn)生的柚苷酶進(jìn)行脫苦具有條件溫和、無(wú)污染、無(wú)次級(jí)產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn),是最具前景、最理想的脫苦方法。目前市場(chǎng)上還缺乏可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的商品酶,其主

2、要原因是缺乏產(chǎn)柚苷酶的高產(chǎn)菌株。在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室以從蜜柚中提取的苦味物質(zhì)為唯一碳源配制選擇性培養(yǎng)基,分離獲得了40株能利用柚皮苷的微生物。本研究從這些菌株中篩選產(chǎn)酶活力高、安全性高的菌株,研究其產(chǎn)酶性質(zhì),選育柚苷酶的高產(chǎn)菌株,為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)。主要內(nèi)容包括：
　　 ⑴對(duì)40株產(chǎn)柚苷酶的微生物進(jìn)行篩選,柚苷酶活力相對(duì)較高的三菌株的編號(hào)分別為DB054、P-127和4-4-1,柚苷酶活力分別為108.6U/mL,103.6

3、U/mL、114.3U/mL。經(jīng)初步鑒定,菌株DB054為曲霉屬(Aspergillus Mich.ex Fr.),菌株P(guān)-127為?，F(xiàn)青霉屬(PenicilliumLk.ex Fr),菌株4-4-1為鐮孢霉屬(Fusarium Lk.ex Fr.)。
　　 ⑵對(duì)黑曲霉DB054產(chǎn)柚苷酶特性研究,確定了菌株產(chǎn)生的柚苷酶為胞外、誘導(dǎo)酶;分析了菌株DB054在搖瓶及5L發(fā)酵罐中的產(chǎn)柚苷酶規(guī)律。黑曲霉DB054存在分解代謝物阻遏,葡萄

4、糖對(duì)柚苷酶的合成具有強(qiáng)烈的抑制作用;黑曲霉DB054的菌絲體形態(tài)對(duì)柚苷酶合成有重大影響,絲狀菌體比球狀菌體更適合發(fā)酵柚苷酶。通過(guò)改變搖床培養(yǎng)方式或培養(yǎng)基中添加乳化劑可以改變菌絲形態(tài)或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),提高細(xì)胞膜的通透性,促進(jìn)在細(xì)胞內(nèi)合成的柚苷酶分泌到胞外。
　　 ⑶對(duì)黑曲霉DB054進(jìn)行人工誘變育種研究,以期篩選到產(chǎn)柚苷酶的高產(chǎn)菌株。用30μL/mL甲基磺酸乙酯對(duì)出芽8h的黑曲霉DB054孢子誘變處理40min,在培養(yǎng)基中添加5mg/

5、mL的二脫氧-D-葡萄糖淘汰低產(chǎn)菌株,用改良的Davis方法制備透明圈,根據(jù)透明圈的HC值初步篩選柚苷酶高產(chǎn)菌株。用透明圈法初篩出的菌株中,產(chǎn)量提高40％以上的突變菌株占11％;用搖瓶培養(yǎng)對(duì)初篩出的菌株進(jìn)行兩輪復(fù)篩柚苷酶高產(chǎn)突變株T-226,搖瓶培養(yǎng)柚苷酶活達(dá)373.4U/mL,比出發(fā)菌株提高了22.7％。對(duì)該高產(chǎn)突變株進(jìn)行5L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn),在發(fā)酵第84h測(cè)得柚苷酶活為631.9U/mL。用新建立的方法選育高產(chǎn)柚苷酶的高產(chǎn)菌株,不僅具有較