與衰老相關異染色蛋白HP1γ相結合的長鏈非編碼RNA的初步篩選與鑒定.pdf

1、目的: 來自基因組的所有轉錄物(transcript)一般可以分為兩類:即編碼蛋白質的mRNA和非編碼RNA(nocoding RNA，nc RNA)。其中，人類基因組轉錄產(chǎn)物中大約有97％-98％是不編碼蛋白質的RNA。根據(jù)非編碼RNA的大小可以將它們大致分為:即小于200nt的稱為小nc RNA(small ncRNAs)，長于200nt的稱之為長nc RNA(Long nocoding RNAs，Lnc RNAs)。長期以來，基因

2、組中大部分非編碼部分通常是被認為沒有生物學功能的。然而新近研究發(fā)現(xiàn)，這些非編碼序列具有與編碼蛋白質的基因同樣重要的生物學功能。
　　非編碼RNA(ncRNA)在細胞中參與轉運以及細胞內各種生物化學反應催化的多種生物功能。一些ncRNA可以影響蛋白質的活性。這是因為RNA分子可以通過結合蛋白質，從而影響相應蛋白質的結構、酶活性及該蛋白質的配體結合活性。已有許多資料表明ncRNA可以通過與蛋白質相互作用而調控基因的表達。ncRNA是高

3、等生物遺傳控制機制的核心物質，構成與體內基因調控和基因間通訊等功能密切相關的高級調節(jié)系統(tǒng)，進而可以通過RNA-DNA/染色質、RNA-RNA和RNA-蛋白質相互作用等方式，在促進真核細胞分化和發(fā)育過程中控制基因表達活性復雜網(wǎng)絡的整合。
　　細胞衰老(Cell Senescence，cellular aging)是指在體外培養(yǎng)正常細胞時，細胞所表現(xiàn)的有限生長特性，經(jīng)一定的細胞倍增次數(shù)后，失去對促分裂因子刺激的反應，不可逆的失去增殖能

4、力而停止分裂的過程。目前研究認為，成纖維細胞的體外增值能力、DNA的損傷修復能力、端粒的長度、DNA的甲基化水平、線粒體DNA的片段缺失、衰老相關β-半乳糖苷酶的活性以及晚期糖基化終產(chǎn)物的水平，均能夠作為評判細胞衰老的生物學指標。細胞衰老與腫瘤的形成是相互對立的，由于細胞永生化是腫瘤發(fā)生的重要前提，而細胞永生化及產(chǎn)生癌變的必要條件則是細胞發(fā)生衰老障礙。細胞不僅可以通過凋亡抑制腫瘤形成，還能夠利用衰老阻止細胞分裂，從而進一步抑制腫瘤的發(fā)生

5、。因而，研究細胞衰老能夠為人類腫瘤的研究與相關疾病的治療提供新的方法和手段，對于人類認識生命的本質具有重要的積極意義。
　　但是，目前關于lncRNA與細胞衰老的關系方面研究的很少，研究比較清楚的與細胞衰老相關的lncRNA只有l(wèi)ncRNA ANRIL(antisense noncoding RNA in theINK4 locus)。這一結果提示非編碼RNA在細胞衰老的過程中可能起到一些關鍵的作用。
　　方法: 本研究利用

6、生物信息學的方法，根據(jù)lnc RNA自身所具有的一種在二級結構約束下的序列信號，結合衰老相關蛋白的二級、三級的空間結構特點，通過長非編碼RNA疾病數(shù)據(jù)庫(LncRNADisease)，對與8種衰老相關蛋白(包括HP1γ，p16INK4a，p53，PML，p21，Rb.FOXO3a，Sirt1)相結合的lnc RNA進行預測。選用人胚肺二倍體成纖維細胞2BS，通過運用Ras誘導、H2O2化學法誘導以及復制性細胞衰老等三種方法，構建了細胞衰

7、老模型作為實驗篩選的模型。隨后，應用oligo6軟件設計引物，以Ras及Rasc處理的衰老細胞和年輕細胞分別做為模型，對與衰老相關蛋白HP1γ可能相結合的lnc RNA進行了引物的純化以及相關lnc RNA的初步篩選;利用real-time PCR分析初步篩選得到的lnc RNA在Ras誘導、H2O2化學法誘導以及復制性衰老三種細胞衰老模型細胞中的表達水平;利用RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation RIP)方

8、法，驗證所篩選出來的lnc RNA能否與HP1γ發(fā)生特異性的結合。
　　結果: 生物信息學預測發(fā)現(xiàn)68種與8種衰老相關蛋白(包括HP1γ，p16INK4a，p53，PML，p21，Rb.FOXO3a，Sirt1)相結合的lnc RNA。real-time PCR分析結果表明，在Ras誘導的衰老細胞中與未衰老的細胞中，8種與HP1γ相關的lnc RNA的表達存在較明顯差異。其中，TCONS_12_00008484、TCONS_12_

9、00008486、TCONS_12_00009414、TCONS_12_00009418以及TCONS_12_00009419等5種與HP1γ相關的lnc RNA，與年輕的細胞相比，在Ras誘導、H2O2化學法誘導以及復制性衰老三種細胞衰老模型細胞中的表達水平升高。RIP分析證明，上述篩選得到的與HP1γ相關的5種lnc RNA，其中TCONS_12_00008486，TCONS_12_00009418和TCONS_12_0000941