金霉素生物合成及其工業(yè)菌株代謝工程.pdf

1、金霉素(Ch Iortetracycline)屬于廣譜抗生素，它是從土壤微生物——金黃色鏈霉菌中（Streptomyces aureofaciens）分離出來，是四環(huán)素類抗生素家族第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員。該家族抗生素通過與細(xì)菌核糖體30S小亞基的氨酰-tRNA位點(diǎn)（A位點(diǎn)）的特異性結(jié)合，阻止肽鏈的延伸，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮抗菌作用。由于抗菌譜廣，治療感染等疾病效果顯著，四環(huán)素類抗生素在臨床上取得了巨大的成功。加上四環(huán)素類抗生素具有

2、獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗菌機(jī)制，一直到現(xiàn)在，科學(xué)家們依然對(duì)其保持著濃厚的研究興趣。四環(huán)素類抗生素的研究已經(jīng)涵括了生物化學(xué)、微生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、合成化學(xué)、合成生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科。
　　早期關(guān)于四環(huán)素類抗生素生物合成機(jī)制的研究，主要集中在金黃色鏈霉菌一些隨機(jī)突變株產(chǎn)生的中間體上。但是由于遺傳操作瓶頸，四環(huán)素類生物合成的機(jī)制，特別是一些關(guān)鍵步驟，并沒有非常明確的結(jié)論。最近幾年，UCLA唐奕小組通過異源表達(dá)和體外生化實(shí)驗(yàn)，報(bào)道了龜裂

3、鏈霉菌（Streptomyces rimosus）所產(chǎn)土霉素的生物合成的研究，包括起始單元和后修飾中的幾步氧化反應(yīng)，人們逐漸了解了四環(huán)素類生物合成的一些細(xì)節(jié)。
　　本研究從一株經(jīng)過長期誘變、高產(chǎn)金霉素的金黃色鏈霉菌工業(yè)菌株出發(fā)，首次建立了金黃色鏈霉菌的遺傳操作體系，旨在通過中斷目標(biāo)基因所積累產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和體外酶促生化反應(yīng)，揭示金霉素生物合成的分子機(jī)制，為合成新的四環(huán)素類化合物和其它Ⅱ型PKS的研究提供理論依據(jù)。
　　本研究根據(jù)

4、已報(bào)道的四環(huán)素生物合成基因簇中氯代酶基因序列設(shè)計(jì)探針，從金黃色鏈霉菌基因組Fosmid文庫中成功克隆到完整的金霉素生物合成基因簇。前期工作中，用傳統(tǒng)穿梭質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法，始終無法建立金黃色鏈霉菌的遺傳操作體系。根據(jù)分子生物學(xué)重組原理，我們改進(jìn)了方法:利用Fosmid兩個(gè)較大同源臂（至少有一個(gè)在20kb以上）具有相對(duì)較高的同源重組效率，成功地進(jìn)行了金黃色鏈霉菌的基因敲除。首先在E.coil BW25113中通過入-Red重組酶介導(dǎo)同

5、源重組，在Fosmid11D1(包含金霉素合成完整基因簇ctc)上將目標(biāo)基因用oriT+ Spec片段置換;然后利用E coli ET12567與Streptomyces之間的接合轉(zhuǎn)移體系，將突變后的Fosmid與金黃色鏈霉菌染色體進(jìn)行同源重組，得到最終的金黃色鏈霉菌突變株。本研究先后中斷了金霉素生物合成過程中氯代酶基因（ctcP）、合成起始相關(guān)基因（ctcT/ctcl）、所有環(huán)化酶基因（ctcD/F/H）和兩個(gè)氧化酶基因(ctcX/E

6、)，通過對(duì)突變株產(chǎn)物進(jìn)行分析，更清晰地闡明了金霉素生物合成途徑。
　　與其它四環(huán)素類抗生素生物合成過程不同，金霉素生物合成過程中存在一步氯化反應(yīng)，本研究首先將負(fù)責(zé)氯化反應(yīng)的氯代酶(CtcP)進(jìn)行了中斷。本研究的出發(fā)菌株金霉素的產(chǎn)量達(dá)到15 g/L(92％)，含有7.8％左右的四環(huán)素副產(chǎn)物（約1.2 g/L）;工業(yè)生產(chǎn)過程中，通過向培養(yǎng)基中添加2.0％(g/L)的溴化鉀(KBr)抑制氯化反應(yīng)，用來生產(chǎn)四環(huán)素。將氯代酶基因敲除之后，突

7、變菌株ZT04發(fā)酵產(chǎn)物只積累“干凈”的四環(huán)素，其產(chǎn)量達(dá)到工業(yè)水平(18 g/L)。分別在天然啟動(dòng)子和紅霉素強(qiáng)啟動(dòng)子控制下，將ctcP基因回補(bǔ)到突變株ZT04，均恢復(fù)了產(chǎn)金霉素的能力。據(jù)此，我們初步推斷氯代酶負(fù)責(zé)的氯化反應(yīng)應(yīng)該是發(fā)生在最后一步——催化四環(huán)素在C7位加上一個(gè)氯原子得到金霉素。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證氯代酶CtcP的功能，用在大腸桿菌中異源表達(dá)的CtcP（及其輔酶CtcQ）在體外重構(gòu)了該步氯化反應(yīng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，CtcP具有

8、酶分子典型特征:既具有酶分子催化底物的立體專一性，又表現(xiàn)出一定的底物柔性。在體外反應(yīng)中，CtcP專一性地催化4S絕對(duì)構(gòu)型的四環(huán)素底物(kcat=0.51±0.01 h-1)，但是不能夠催化4R構(gòu)型的底物。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，4S構(gòu)型的四環(huán)素類在體外能夠自發(fā)異構(gòu)為4R產(chǎn)物。我們推測這種轉(zhuǎn)變是一種熱力學(xué)平衡過程，4R構(gòu)型在熱力學(xué)上更穩(wěn)定，發(fā)酵產(chǎn)物中4S構(gòu)型產(chǎn)物同樣向4R構(gòu)型產(chǎn)物自動(dòng)轉(zhuǎn)化。與此同時(shí)，CtcP能夠催化兩種四環(huán)素結(jié)構(gòu)類似物——2-乙酰基-2

9、-脫胺甲酰-四環(huán)素(2-ADTC)和6-脫甲基-四環(huán)素(6-DMTC)產(chǎn)生了痕量的氯代產(chǎn)物，只能通過LC-MS檢測到;另一種四環(huán)素結(jié)構(gòu)類似物——土霉素則不能被氯代。
　　根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究在工業(yè)菌株中提高了氯代酶基因的表達(dá)水平，試圖將發(fā)酵過程中少量的四環(huán)素積累完全轉(zhuǎn)化為金霉素。構(gòu)建具有紅霉素強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*的基因表達(dá)載體，串聯(lián)重復(fù)ctcP基因1至5個(gè)拷貝，通過鏈霉菌整合型質(zhì)粒分別將它們整合到金黃色鏈霉菌的基因組上，5組突

10、變株不同程度的提高了金霉素產(chǎn)量，最終篩選到一株金霉素產(chǎn)量提高至173％(26 g/L)的突變株。RT-PCR結(jié)果顯示，金霉素產(chǎn)量的提高與氯代酶轉(zhuǎn)錄水平的提高相一致。但是，所有突變株四環(huán)素積累并不能夠完全消除，只是比例比原始菌株的7.8％略微下降(5.5％-7.1％)，推測原因可能是由于四環(huán)素和金霉素在發(fā)酵一開始就會(huì)被外排出細(xì)胞。至此，可以得出結(jié)論:氯代酶在金霉素生物合成過程中是最后一步反應(yīng)，負(fù)責(zé)在四環(huán)素C7位置上加載氯原子，并且由于氯代

11、酶催化效率不高，氯代反應(yīng)不完全，導(dǎo)致在金霉素發(fā)酵產(chǎn)物中還存在少量四環(huán)素。
　　在Ⅱ型PKS中，四環(huán)素類具有的一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)是其2-氨甲酰結(jié)構(gòu)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，天冬酰胺轉(zhuǎn)氨酶負(fù)責(zé)以丙二酸單酰CoA合成該起始單元，但是其反應(yīng)底物和具體反應(yīng)機(jī)制還沒有弄清楚。將ctc基因簇中的天冬酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因(ctcT)中斷，意外地發(fā)現(xiàn)突變株積累以乙酰基為起始單元的兩種產(chǎn)物:2-乙?；?2-脫氨甲酰-四環(huán)素(4S和4R，約1-2 g/L)。同時(shí)在ctc基因

12、簇中，我們推測另外一個(gè)?；鵆oA連接酶基因(ctcl)與起始單元2-氨甲酰合成有關(guān):該基因只存在于四環(huán)素類生物合成基因簇中，將ctcl中斷，突變株仍產(chǎn)金霉素和四環(huán)素，只是產(chǎn)量均降低到出發(fā)菌株的1％左右。據(jù)此，我們認(rèn)為四環(huán)素類生物合成過程中，天冬酰胺合成酶CtcT負(fù)責(zé)起始單元的轉(zhuǎn)氨，酰基CoA連接酶Ctcl負(fù)責(zé)產(chǎn)物加載到CoA上;推測基因組上其它的?；鵆oA連接酶能夠識(shí)別乙酰基起始單元，少量互補(bǔ)Ctcl的功能，這個(gè)特征在其它Ⅱ型PKS中也

13、有報(bào)道。
　　將三個(gè)環(huán)化酶基因敲除后，根據(jù)突變株積累的產(chǎn)物，本研究明確了金霉素環(huán)化酶對(duì)應(yīng)順序:環(huán)化酶CtcH負(fù)責(zé)金霉素B環(huán)的形成，環(huán)化酶CtcD負(fù)責(zé)金霉素A環(huán)的形成;環(huán)化酶CtcF與土霉素基因中OxyK同源，后者被證實(shí)負(fù)責(zé)第一個(gè)環(huán)——D環(huán)的形成;至于金霉素（包括四環(huán)素類）結(jié)構(gòu)中C環(huán)的形成機(jī)制，仍然有待研究。
　　最后，我們通過基因敲除研究了氧化酶的功能:將氧化酶基因ctcX敲除后，金霉素（約5 g/L）和四環(huán)素產(chǎn)量均不到出發(fā)