酒精生產(chǎn)酵母菌株木糖代謝工程及其發(fā)酵工藝的初步研究.pdf

1、全球經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展導(dǎo)致以石油為代表的不可再生的各類礦物質(zhì)資源日益短缺，尋找可再生性能源成為必然的趨勢(shì)。燃料酒精是公認(rèn)的最有發(fā)展前景的可再生清潔能源之一。以木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)燃料酒精不僅能夠降低燃料乙醇生產(chǎn)的原料成本，同時(shí)在廢物處理、環(huán)境保護(hù)等方面起到一定的作用。木糖是木質(zhì)纖維素水解物中含量?jī)H次于葡萄糖的一種單糖。木糖的有效利用是木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。運(yùn)用途經(jīng)工程改造酒精生產(chǎn)菌株使其具有共代謝葡萄糖和木糖的能力和利

2、用發(fā)酵工程技術(shù)優(yōu)化生產(chǎn)工藝使重組菌株木糖代謝能力得到最大限度的發(fā)揮是轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源酒精生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化的重要基礎(chǔ)措施。 本文以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)工業(yè)生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，在建立工業(yè)菌株轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因工程(MetabolicEngineering)手段，將木糖代謝的關(guān)鍵酶基因引入酒精生產(chǎn)釀酒酵母工業(yè)菌株中，得到了能共發(fā)酵木糖和葡萄糖產(chǎn)生酒精的工程菌株；運(yùn)用發(fā)酵工程技術(shù)對(duì)工程重

3、組菌株的酒精發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)培養(yǎng)基的組成和木糖代謝最大影響因素溶氧、pH等參數(shù)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行優(yōu)化，取得了較好發(fā)酵結(jié)果。主要研究?jī)?nèi)容為： 釀酒酵母工業(yè)菌株轉(zhuǎn)化體系的建立。釀酒酵母工業(yè)菌株往往沒有實(shí)驗(yàn)室酵母所具有的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，只能利用某些顯性標(biāo)記，而且由于不同工業(yè)菌株細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、生理生化特征及遺傳背景相差很大，轉(zhuǎn)化方法也與實(shí)驗(yàn)室菌株的轉(zhuǎn)化有所不同。本文選用酵母菌廣泛適用的G418抗性基因作為顯性選擇標(biāo)記，通過(guò)敏感度實(shí)驗(yàn)測(cè)定

4、了G418作用于酒精生產(chǎn)菌株6508、1308、NAN-27和自絮凝酵母SPSC-1的最低抑菌濃度。發(fā)現(xiàn)不同菌株對(duì)G418的敏感性有較明顯的差異，因此針對(duì)不同酵母工業(yè)菌株之間的差異，需要選用不同的轉(zhuǎn)化子篩選體系。 酵母的自絮凝性在酒精清液發(fā)酵工藝中可以使細(xì)胞在生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)無(wú)載體固定化，利于發(fā)酵后處理，是良好的工業(yè)生產(chǎn)性能。但基因操作中轉(zhuǎn)化子的篩選是以單細(xì)胞菌落為基礎(chǔ)的，因此這一特性又給其分子生物學(xué)操作帶來(lái)困難，其解決措施是對(duì)

5、絮凝酵母進(jìn)行解絮凝處理。為此對(duì)絮凝酵母SPSC-1分別采用聚焦光束反射測(cè)量?jī)x(FBRM)以機(jī)械力剪切和EDTA鰲合Ca2+解除相鄰細(xì)胞壁組分的陰離子基團(tuán)連接的化學(xué)法探討了自絮凝酵母SPSC-1的解絮凝條件。研究發(fā)現(xiàn)物理法解絮凝效果不佳，而使用EDTA鰲合Ca2+可以較長(zhǎng)時(shí)間地保持細(xì)胞的游離狀態(tài)。通過(guò)濃度梯度的EDTA解絮凝效果實(shí)驗(yàn)，確定50mmol/lEDTA為SPSC-1解絮凝的最佳濃度，在去除EDTA后，酵母可以恢復(fù)原來(lái)的自絮凝特性

6、，對(duì)酵母自身工藝特點(diǎn)上的優(yōu)勢(shì)不產(chǎn)生影響。 根據(jù)酒精生產(chǎn)對(duì)酵母菌株性狀的要求，為了使外源基因在酵母中穩(wěn)定表達(dá)，必需將外源基因整合到酵母工業(yè)菌株染色體上，為此構(gòu)建了單拷貝整合載體pYIK和多拷貝整合載體pYMIK，載體帶有PGK強(qiáng)啟動(dòng)子及G418抗性基因。pYIK的同源重組區(qū)含有URA3，pYMIK中以rDNA作為整合位點(diǎn)，由于rDNA在酵母染色體上有多個(gè)重復(fù)，可以滿足外源基因多拷貝整合的需求。 將來(lái)自畢赤氏酵母Pichia

7、stipitis的木糖還原酶基因(XYL1)、木糖醇脫氫酶基因(XYL2)和釀酒酵母自身的木酮糖激酶基因(XKS1)分別連接到單拷貝整合載體pYIK和多拷貝整合載體pYMIK上，得到了重組質(zhì)粒pYIK-123和pYMIK-127。將之轉(zhuǎn)化入釀酒酵母工業(yè)菌株，在含G418和以木糖為唯一碳源的YPX平板上篩選轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)提高G418濃度增加篩選壓力和木糖生長(zhǎng)測(cè)定的方法二次篩選，得到含有低拷貝和多拷貝木糖代謝基因XYL1、XYL2、XKS的

8、重組酵母菌，菌株分別稱為NAN-123、NAN-127。重組菌在無(wú)選擇壓力培養(yǎng)條件下酶活測(cè)定表明，木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)均在釀酒酵母中得到活性表達(dá)。 將NAN-123、NAN-127在氧氣限量的條件下，進(jìn)行木糖葡萄糖共發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。工程菌與宿主菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)表明外源基因的引入對(duì)菌體的生長(zhǎng)沒有影響。HPLC發(fā)酵產(chǎn)物分析表明各重組菌都能利用木糖產(chǎn)生乙醇。其中，NAN-127利用木糖生產(chǎn)乙醇的結(jié)果優(yōu)于N

9、AN-123和宿主菌。NAN-127對(duì)木糖的利用最高可達(dá)20.6g/L，較宿主菌提高了18.6g/L，乙醇產(chǎn)量最高可達(dá)9.3g/L，較宿主菌提高31％；而NAN-123利用木糖的最大值是10.1g/L，較宿主菌提高了8.1g/L，產(chǎn)生的乙醇最大值是8.4g/L，較宿主菌提高了18％。以上結(jié)果表明高拷貝整合外源基因的工程菌NAN-127具有較優(yōu)良的發(fā)酵性能，因此我們選用其進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化。 根據(jù)可利用的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解液中葡萄

10、糖和木糖的組成比例和酒精工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)高糖醪液的需求，確定了發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖和木糖的比率為2∶1，濃度分別為100g/L、50g/L。采用自行改進(jìn)的厭氧瓶，進(jìn)行兼性厭氧搖瓶發(fā)酵，分析結(jié)果表明，工程菌株NAN-127發(fā)酵40小時(shí)即可生成大部分的酒精，之后酒精積累較為平緩；木糖的消耗貫穿整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，發(fā)酵96小時(shí)酒精得率為0.44gethanol/gsugarconsumed，木糖利用率53.6％，大大高于常規(guī)搖瓶發(fā)酵條件下酒精得率和木糖利

11、用率(0.16gethanol/gsugarconsumedand31％respectively)。 培養(yǎng)基中有機(jī)氮源的含量對(duì)木糖代謝有較大的影響，有機(jī)氮含量過(guò)高會(huì)使副產(chǎn)物增多且會(huì)降低酵母菌對(duì)酒精的耐受力從而影響菌株發(fā)酵性能。參考酒精生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)基組分，進(jìn)行培養(yǎng)基配比的優(yōu)化，調(diào)整了YEPD培養(yǎng)基中酵母粉和蛋白胨的含量和比率，確定了小罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基配方。 對(duì)NAN-127進(jìn)行小罐分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。根據(jù)對(duì)木糖利用影響因素最

12、大的溶氧和pH，設(shè)計(jì)了不同梯度的單因子實(shí)驗(yàn)。通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和pH使釀酒酵母工業(yè)重組菌分別處于厭氧、兼性厭氧和微好氧的不同發(fā)酵狀態(tài)，分析表明在通氣量0.05vvm、pH4.5的發(fā)酵條件下，NAN-127的木糖利用率達(dá)到82.1％，酒精產(chǎn)量達(dá)到52.1g/L。與最初的發(fā)酵結(jié)果相比，工業(yè)工程菌對(duì)木糖的利用得到大大提高，木糖代謝可以較順利的進(jìn)行，證明通過(guò)發(fā)酵工藝的優(yōu)化工程菌得以較高水平的發(fā)揮代謝木糖的能力，基本達(dá)到優(yōu)化的目的。 對(duì)比分析

13、了不同釀酒酵母生產(chǎn)菌株的耐溫性、酒精耐受性。選擇具有各自優(yōu)良性狀的1308、6508作為受體菌，用多拷貝重組質(zhì)粒pYMIK-127轉(zhuǎn)化，得到了多拷貝整合XYL1、XYL2、XKS1基因的工程菌株1308-127、6508-127。將NAN-127、1308-127、6508-127在優(yōu)化的發(fā)酵條件(通氣量0.05vvm，pH4.5)下共發(fā)酵葡萄糖和木糖，工程菌株均表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性狀。NAN-127、1308-127、6508-127木