海棲熱袍菌和重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)極耐高溫木聚糖酶及酶的化學(xué)修飾.pdf

1、該論文研究了海棲熱袍菌和含極耐高溫木聚糖酶B的基因的重組畢赤酵母的的發(fā)酵條件的優(yōu)化,并在通過(guò)較簡(jiǎn)單的分離純化后,研究了極耐高溫木聚糖酶B的化學(xué)修飾,得到的主要結(jié)論如下:1.對(duì)海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)搖瓶產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)顯示,玉米芯木聚糖是最好的碳源,酵母提取物要優(yōu)于其他有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮,該菌株最適產(chǎn)酶pH是6.5,培養(yǎng)基的最適NaCl濃度為2.28﹪,添加表面活性劑作用較小.海棲熱袍菌的最高產(chǎn)酶酶活為0.50 U/mL

2、.2.對(duì)畢赤酵母搖瓶產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)顯示,接種量初始OD<,600>=8是最合適的接菌時(shí)間,最適初始pH=5.0,1.5﹪甲醇濃度為最適誘導(dǎo)甲醇濃度,添加0.1﹪Triton114時(shí)產(chǎn)酶量可以增加到原來(lái)的2倍以上,接近海棲熱袍菌酶活的10<'4>倍.在5L發(fā)酵罐上,甲醇流加速度為3mL/(h.L),10天培養(yǎng)后,畢赤酵母的菌體量可以達(dá)到OD<,600>=260,實(shí)現(xiàn)了高密度發(fā)酵,極耐高溫木聚糖酶酶活達(dá)到108 U/mL,外源蛋白量為207 mg

3、/L.3.經(jīng)過(guò)SephadexG-25脫鹽處理、熱處理和D<,380>離子交換層析,得到電泳單一帶的極耐高溫木聚糖酶B.在SDS-PAGE計(jì)算得到重組木聚糖酶的分子量大概在41.8kDa,比大腸桿菌中木聚糖酶分子量要小.4.化學(xué)修飾結(jié)果表明酶蛋白分子上的色氨酸和谷氨酸(或天冬氨酸)殘基是維持酶活性的必需基團(tuán).半胱氨酸、精氨酸、絲氨酸及組氨酸殘基均不處于酶活性中心.修飾酶的假一級(jí)常數(shù)的測(cè)定證實(shí)有一個(gè)色氨酸殘基和一個(gè)谷氨酸(或天冬氨酸)殘基