重組金屬β-內(nèi)酰胺酶的制備及快速檢測(cè)試紙的研制.pdf

1、金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo-beta-lactamase簡(jiǎn)稱(chēng)金屬酶、MBLs）是一類(lèi)需要金屬離子協(xié)助才能發(fā)揮催化活性的一類(lèi)廣譜β-內(nèi)酰胺酶。它能夠水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使該類(lèi)抗生素失去活性。然而目前對(duì)于金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性測(cè)定缺乏有針對(duì)性的方法，普遍是借鑒測(cè)定青霉素酶酶活的碘量法進(jìn)行測(cè)定。
　　目的:建立pET21a/d-CcrA質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及純化方法，并獲得高純度的金屬β-內(nèi)酰胺酶Ce

2、rA;使用傳統(tǒng)的碘量法測(cè)定金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性并進(jìn)行評(píng)價(jià);使用羥胺法對(duì)金屬β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行活性測(cè)定，并優(yōu)化反應(yīng)條件;設(shè)計(jì)一款操作簡(jiǎn)單便捷，結(jié)果準(zhǔn)確直觀(guān)的金屬β-內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)試紙。
　　方法:將pET21 a/d-CcrA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細(xì)菌中，構(gòu)建菌種，而后通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，對(duì)目的蛋白進(jìn)行大量表達(dá)。再使用超聲破碎的方法，透析獲得粗蛋白。粗蛋白經(jīng)過(guò)Q-Sepharose柱純化，對(duì)收集的餾分用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，

3、合并后超濾獲得高純度的目的蛋白;用傳統(tǒng)碘量法對(duì)金屬β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行定量測(cè)定，通過(guò)對(duì)不同批次的產(chǎn)品分別進(jìn)行平行試驗(yàn)，記錄檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì);用羥胺法對(duì)金屬β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行定量測(cè)定，分析各個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，并最終確定實(shí)驗(yàn)的條件;在羥胺法的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)金屬β-內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)試紙及相關(guān)的比色卡。
　　結(jié)果:用Q-Sepharose柱純化分離粗蛋金屬β-內(nèi)酰胺酶CcrA的粗蛋白溶液，通過(guò)0-0.5MNaCl梯度洗脫，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE

4、分析鑒定，確定0.3和0.4M洗脫峰純度最高。而后將二者合并并分別用碘量法和羥胺法進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)對(duì)結(jié)果的分析比較發(fā)現(xiàn)，碘量法測(cè)定的偏差比較大，干擾因素多（實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要避光，終點(diǎn)判斷依靠個(gè)人主觀(guān)認(rèn)定等），而且操作麻煩時(shí)間長(zhǎng)（5h左右），羥胺法相對(duì)的時(shí)間比較短（1.5h左右），而且干擾因素比較少，結(jié)果重復(fù)性好更為可靠(R2=0.9976)，操作也比較方便，以美羅培南作為底物更有針對(duì)性。同時(shí)，本次研究還對(duì)金屬β-內(nèi)酰胺酶的酶活進(jìn)行了重新定義，

5、能更簡(jiǎn)單直觀(guān)的反應(yīng)其活性。在羥胺法的基礎(chǔ)上，根據(jù)顯色結(jié)果和酶活之間關(guān)系，設(shè)計(jì)了快速檢測(cè)試紙和相對(duì)應(yīng)的比色卡。進(jìn)一步簡(jiǎn)化了操作的過(guò)程，為實(shí)際生產(chǎn)檢驗(yàn)提供了幫助。
　　結(jié)論:
　　1、建立了金屬β-內(nèi)酰胺酶CcrA的表達(dá)和純化方法，獲得高純度，活性高的目的蛋白溶液;
　　2、本研究對(duì)金屬β-內(nèi)酰胺酶的酶活進(jìn)行了重新定義，新定義更直觀(guān)，簡(jiǎn)單地反應(yīng)了其作用;
　　3、設(shè)計(jì)了金屬β-內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)試紙，可以對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行