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文檔簡介
1、腫瘤的抗體導(dǎo)向酶—前藥療法(antibody-directedenzymeprodrugtherapy,ADEPT)是將單抗與酶制成偶聯(lián)物,注射到含有對應(yīng)抗原的腫瘤患者體內(nèi),利用單抗將酶導(dǎo)入并駐留于腫瘤部位,經(jīng)過一段時間,待血液和其它組織中抗體-酶偶聯(lián)物廓清之后,給予無毒性的前藥,腫瘤部位的酶將前藥轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚运幬铮瑲⑺滥[瘤細胞。
ADEPT結(jié)合了單抗的靶向性和酶的高效性,同時能提供旁觀者效應(yīng)殺死單抗-酶偶聯(lián)物結(jié)合細胞周圍的
2、腫瘤細胞。ADEPT系統(tǒng)的設(shè)計包括抗體優(yōu)化,使其保留靶向性降低免疫原性;酶的選擇;偶聯(lián)物的構(gòu)建;前藥的設(shè)計,合成,優(yōu)化等方面。為了實現(xiàn)靶向性治療,單抗-酶偶聯(lián)物在生理條件下應(yīng)有活性,低免疫原性,最好不要選用人體內(nèi)源性的酶以避免前藥在正常組織被激活。
單抗-酶偶聯(lián)物設(shè)計的重要前提是要保證抗體對抗原的結(jié)合能力和酶的催化活性。其偶聯(lián)的化學(xué)鍵應(yīng)穩(wěn)定,因為給予偶聯(lián)物和前藥之間有一定的時間間隔,需要等正常組織和血液中的偶聯(lián)物廓清,在這
3、段時間內(nèi)抗體-酶偶聯(lián)物之間不能斷裂。以保證其停留在腫瘤部位。
ADEPT應(yīng)用的前藥為酶的底物與細胞毒性藥物的偶聯(lián)物,前藥本身無毒性或毒性很小,只有被酶激活,才會釋放原藥產(chǎn)生細胞毒性。由于腫瘤部位易滲漏,因此應(yīng)選擇半衰期短的原藥;烷化劑和核酸嵌合劑由于其與靶分子的結(jié)合多是不可逆的,半衰期短,且其代謝物無毒性較為適合做ADEPT系統(tǒng)的原藥。
RGD4C(ACDCRGDCFCG),是含有兩個二硫鍵的環(huán)形RGD多肽,
4、對腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞的結(jié)合能力很強。在重組蛋白的研究中,有很多研究小組將RGD4C與腫瘤壞死因子、白細胞介素等大分子重組后得到新的靶向蛋白,具有很好的靶向性且不影響所連蛋白生物活性。RGD4C具有分子量小,特異性高的特點,比較適合作為ADEPT系統(tǒng)中的抗體部分。
β-內(nèi)酰胺酶是一個單鏈蛋白,分子量相對較小,性質(zhì)穩(wěn)定且易于純化;其與單抗組成的融合蛋白,在血漿中的清除速度快,應(yīng)用于ADEPT時不需要使用清除抗體,可在注射融合
5、蛋白一定時間待其與腫瘤細胞結(jié)合后直接給予前藥進行治療,治療方案簡單;β-內(nèi)酰胺酶與底物親和力高,作用時不需要輔酶;作為一種可溶性蛋白,β-內(nèi)酰胺酶可以在大腸桿菌中量產(chǎn),便于產(chǎn)業(yè)化;因此非常適合作為ADEPT系統(tǒng)中的酶。
我們選擇RGD4C和β-內(nèi)酰胺酶(βL)重組構(gòu)建RGD4C-β-內(nèi)酰胺酶融合蛋白(RGD4CβL)作為ADEPT系統(tǒng)的單抗-酶偶聯(lián)物,并考察了該融合蛋白的活性,血漿穩(wěn)定性,免疫原性,靶向性;并合成了對應(yīng)的前
6、藥頭孢-美法侖,檢測了RGD4CβL對前藥的催化活性,考察了該系統(tǒng)對人乳腺癌細胞MCF-7的殺傷作用。
本實驗采用頭孢硝噻吩作為底物,考察RGD4CβL的活性;并以人血漿孵育的方法考察了RGD4CβL的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明RGD4CβL保留了β-內(nèi)酰胺酶的催化活性,其在人血漿中37℃孵育14天仍保留了較好的活性。
本實驗采用人外周血單核細胞增殖試驗和小鼠脾細胞增殖試驗考察RGD4CβL的免疫原性,實驗結(jié)果表明
7、RGD4CβL對人外周血單核細胞和小鼠脾細胞的刺激作用均在可接受范圍,具有較小的免疫原性。
本實驗采用流式細胞術(shù)考察了RGD4CβL對MCF-7細胞的結(jié)合能力;并用放射性125I標記,利用小動物活體成像和組織分布實驗考察了RGD4CβL在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布特性。實驗結(jié)果表明RGD4CβL對MCF-7細胞有較好的結(jié)合能力,且該能力與RGD4C相當;活體成像和組織分布實驗表明,RGD4CβL在腫瘤組織的分布高于正常組織,且主要
8、通過泌尿系統(tǒng)代謝。兩個實驗證明RGD4CβL具有一定的腫瘤靶向性。
本實驗合成了RGD4CβL的對應(yīng)底物,頭孢-美法侖前藥;并用細胞增殖試驗考察了RGD4CβL-頭孢美法侖系統(tǒng)對MCF-7細胞的作用。實驗結(jié)果表明RGD4CβL和頭孢美法侖前藥對細胞無毒性;只有在兩者聯(lián)合應(yīng)用時才能釋放原藥美法侖產(chǎn)生細胞毒作用。
通過以上實驗可以得知,RGD4CβL融合蛋白保留了RGD4C的靶向性和β-內(nèi)酰胺酶的催化活性,且具有
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