青霉素高產(chǎn)菌株HTS平臺(tái)的建立.pdf

1、青霉素是重要的β-內(nèi)酰胺類抗生素，青霉素高產(chǎn)菌株的選育是提高青霉素產(chǎn)量的最有效的途徑之一，目前，菌種選育的主要策略有兩種，其一是理性策略，即根據(jù)菌株已知的代謝途徑及調(diào)控機(jī)制，有目的進(jìn)行途徑或基因改造策略，其二是非理性策略，包括完全隨機(jī)策略或半理性策略，即在不清楚或不完全清楚代謝途徑及調(diào)控機(jī)制的背景下，對(duì)菌株進(jìn)行遺傳改變，從大量突變株中獲得優(yōu)秀菌株。青霉素屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，受多種信號(hào)的調(diào)節(jié)控制，并且，現(xiàn)有的優(yōu)秀菌株再次遺傳改造更容易導(dǎo)致負(fù)

2、突變，因此采用非理性策略進(jìn)行菌株篩選更為適宜，非理性策略主要分為兩個(gè)階段：(1)獲得大量突變株；(2)篩選大量突變株。
　　 本研究主要任務(wù)是建立篩選大量突變株的平臺(tái)，即高通量的篩選平臺(tái)。高通量的篩選平臺(tái)有兩個(gè)技術(shù)體系：其一是高通量的培養(yǎng)技術(shù)，其二是高通量的檢測(cè)技術(shù)，兩個(gè)技術(shù)相輔相成構(gòu)成一個(gè)完整的篩選平臺(tái)。本研究創(chuàng)造性的完成了產(chǎn)黃青霉的高通量的培養(yǎng)技術(shù)，采用24孔板漂浮靜止培養(yǎng)，解決了絲狀真菌微孔培養(yǎng)的溶氧難題，培養(yǎng)過程簡單，體

3、系穩(wěn)定，比傳統(tǒng)的搖瓶培養(yǎng)效率至少提高50倍，即每天至少可以同時(shí)培養(yǎng)5000株單孢子菌株，并且培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，可以同時(shí)獲得高產(chǎn)菌株的無性孢子。
　　 本研究創(chuàng)造性的完成了青霉素的高通量的檢測(cè)技術(shù)，采用青霉素酶對(duì)青霉素的專一降解原理，輔助碘液與淀粉的指示系統(tǒng)，建立了準(zhǔn)確、快速、不受發(fā)酵液其它組分干擾的高通量的檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)既可以高通量定量檢測(cè)，即在10 min 內(nèi)完成超過100個(gè)樣品的青霉素測(cè)定，更可以高通量完成篩選檢測(cè)，即在10分鐘

4、內(nèi)完成500個(gè)樣品的相對(duì)比較，淘汰90[％]的低效價(jià)菌株，比現(xiàn)有液相檢測(cè)方法效率至少提高100倍。對(duì)建立的高通量篩選平臺(tái)進(jìn)行了初步運(yùn)行與驗(yàn)證：采用紫外和亞硝酸誘變產(chǎn)黃青霉菌體，獲得480個(gè)突變株，篩選出一株生長快，產(chǎn)孢早的菌株，微培養(yǎng)體系效價(jià)10457U/mL，搖瓶效價(jià)21442 U/mL，比一般菌株發(fā)酵周期縮短10h，搖瓶發(fā)酵單位平均提高了7.90[％]。采用該篩選平臺(tái)的高通量的培養(yǎng)技術(shù)，研究了影響青霉素孢子產(chǎn)生的因素以及該因素與青霉