牛乳過敏原β-乳球蛋白制備、中試生產(chǎn)設計及其致敏性的細胞學評估.pdf

1、食物過敏是食物中某種成分（變應原或過敏原）刺激人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一種異常的病理性免疫應答。八大類食物過敏原中牛乳過敏較為普遍，而β-乳球蛋白是牛乳主要的過敏原之一，由反芻動物乳腺上皮細胞合成，含量約占乳清蛋白總量的55％，人乳中則不含有。
　　本文采用制備型反相高效液相色譜獲得高純度的牛乳過敏原β-乳球蛋白，對其進行輻照協(xié)同超聲非熱加工處理。通過光譜學方法表征不同加工處理后過敏原的結構特征，在此基礎上，利用人外周血嗜堿性粒細胞 KU

2、812，建立體外細胞模型評估蛋白致敏性變化。文章關鍵的實驗方法、現(xiàn)象結果及結論表述如下。
　　1.建立制備型反相高效液相色譜儀（C18）分離純化牛乳過敏原β-乳球蛋白的方法，小試實驗僅用25 min，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，得到的β-乳球蛋白純度達到98.2%，得率為32.25%?；谛≡噮?shù)進行十倍放大的中試工藝設計，選取C18色譜柱（直徑25 mm，長度250 mm），上樣量100 mL，體積10 mg/mL，并完成設備的選型

3、，繪制工藝流程圖和設備流程圖。
　　2.牛乳過敏原β-乳球蛋白經(jīng)超聲（40KHz，300W，30min）和輻照（5 kGy）協(xié)同處理，分為四組：原蛋白組，輻照組；先超聲后輻照組，先輻照后超聲組。加工后蛋白發(fā)生不同程度的聚合，一級和空間結構均發(fā)生不同程度的改變。在蛋白聚合過程中，二級結構從無序轉為有序狀態(tài)，Trp19基團向 Arg124運動，熒光強度被部分猝滅，疏水基團包埋，熒光強度降低。并且，加工蛋白三級結構也發(fā)生改變，二硫鍵Cy

4、s106-Cys119可能發(fā)生斷裂，既增強了巰基含量又有利于蛋白聚合。間接競爭ELISA法測定加工β-乳球蛋白與IgG的結合，結果顯示結合能力明顯降低，蛋白的部分抗原決定簇被破壞，降低了蛋白抗原性。
　　3.選取對數(shù)生長期KU812細胞（l.0×l06個/mL）進行體外細胞學評估實驗，檢測 KU812細胞脫顆粒釋放的生物活性介質(zhì)：β-HEX、組胺、TNF-α、IL-6以及胞內(nèi)Ca2+濃度變化。結果發(fā)現(xiàn)原蛋白組檢測到的活性物質(zhì)含量最

5、高，外鈣內(nèi)流現(xiàn)象最明顯。Western Blot法檢測KU812細胞激發(fā)后信號通路的Lyn、Syk、NF-κB以及 MAPK家族蛋白的表達情況，原蛋白組信號通路上游和下游的磷酸化蛋白含量都最高，而加工蛋白的磷酸化程度較低。上游信號通路的源頭激酶Lyn、Syk被抑制可以進一步抑制下游通路蛋白，從而抑制整個信號通路的轉導。轉錄因子NF-κB被抑制導致新合成的細胞因子TNF-α和IL-6含量降低。同時，檢測到的信號蛋白證實牛乳過敏可以由IgE