絲素蛋白作為促血管生長(zhǎng)基因載體的研究.pdf

1、血管的再生是組織工程及原位組織再生領(lǐng)域面臨的關(guān)鍵問題。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將促進(jìn)血管再生的生長(zhǎng)因子基因?qū)肽康募?xì)胞并使其表達(dá)，可有效促進(jìn)血管生成。VEGF165和Ang-1是兩種最重要的促血管再生生長(zhǎng)因子。VEGF作用于血管形成的早期，促進(jìn)原始血管網(wǎng)的形成，Ang-1則作用于其后的血管改建、塑形，促進(jìn)形成成熟的且具有空間結(jié)構(gòu)的血管網(wǎng)。聯(lián)合使用VEGF165和Ang-1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，則既有利于相互協(xié)調(diào)共同促進(jìn)血管的形成，又可使新生血管獲得持

2、久穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。為了將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，需要依靠基因傳遞載體。分子量為25kDa的支鏈PEI是迄今最成功的非病毒高分子基因載體，其表面帶有高密度的正電荷，轉(zhuǎn)染效率較高，但細(xì)胞毒性較大。絲素蛋白是一種具有良好細(xì)胞相容性和可降解性的蛋白質(zhì)，絲素分子帶負(fù)電，不能直接包裝DNA，但是能夠屏蔽PEI多余的正電荷，減小細(xì)胞毒性。同時(shí)柞蠶絲素蛋白內(nèi)存在細(xì)胞特異性粘附序列RGD，可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞表面的受體發(fā)生特異性相互作用。因此，用

3、絲素和PEI共同包裝質(zhì)粒DNA，作為基因傳遞載體，可以通過細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的特異性相互作用及其內(nèi)吞作用，代替PEI和細(xì)胞的非特異性靜電相互作用，以降低細(xì)胞毒性，提高轉(zhuǎn)染效率。
　　 本文以絲素和PEI共同作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的傳遞載體，研究與PEI單獨(dú)作為傳遞載體相比，載體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)的變化，及其對(duì)細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率的影響，并對(duì)其影響機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 首先，通過靜電吸附方法制備

4、PEI/DNA復(fù)合物，DNA的含量為2μg/ml。用瓊脂糖凝膠電泳確定能完全包被質(zhì)粒時(shí)，PEI與DNA的N/P比大于3。MTT法證明，細(xì)胞培養(yǎng)液中PEI含量在1-5μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率都在90％以上，細(xì)胞毒性較低。PEI含量為3μg/ml時(shí)(其中，PEI/DNA復(fù)合物的含量為5μg/ml，DNA的含量為2μg/ml)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率最大，且細(xì)胞毒性較低。
　　 其次，分別用柞蠶絲素(Antheraeapernyisi

5、lkfibroin，ASF)和家蠶絲素(Bombyxmorisilkfibroin，BSF)包被PEI/DNA，得到ASF/PEI/DNA和BSF/PEI/DNA復(fù)合物。用X-射線能譜分析了復(fù)合物表面元素的含量變化，證明蠶絲絲素可以結(jié)合到PEI/DNA表面。原子力顯微鏡(AFM)和激光粒度儀(DLS)測(cè)試結(jié)果顯示ASF和BSF都可以包被PEI/DNA形成納米級(jí)顆粒，PEI/DNA的平均粒徑為274.3±3.4nm，ASF/PEI/DNA

6、的平均粒徑是337.6±7.4nm，SF/PEI/DNA復(fù)合物的粒徑與PEI/DNA相比有所增大。ASF/PEI/DNA和BSF/PEI/DNA的表面電位與PEI/DNA相比有明顯降低。SF/PEI/DNA三元復(fù)合物能抵抗核酸酶的降解。
　　 最后，分別用ASF/PEI/DNA和BSF/PEI/DNA轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察轉(zhuǎn)染情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白(GFP)陽性細(xì)胞比率。結(jié)果表明，ASF/P

7、EI/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率比PEI/DNA復(fù)合物的高。轉(zhuǎn)染CHL細(xì)胞后，出現(xiàn)了相似的結(jié)果。MTT法測(cè)試結(jié)果顯示ASF/PEI/DNA組的細(xì)胞存活率大于PEI/DNA組的細(xì)胞存活率。用ASF與PEI共包被DNA后，一方面能夠通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，增強(qiáng)復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的靶向性：另一方面能降低復(fù)合物的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和功能良好，有利于轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而提高VEGF-Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的基因轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染攜帶雙基因片段的質(zhì)粒

8、后，VEGF的分泌比同種條件下的攜帶單基因的質(zhì)粒組分泌的VEGF多。同一時(shí)間點(diǎn)，ASF/PEI/DNA組細(xì)胞比其它組細(xì)胞分泌的VEGF多。證明用ASF與PEI共同包被DNA，不僅能夠提高轉(zhuǎn)染效率，而且轉(zhuǎn)染后的VEGF基因能夠正常表達(dá)、分泌VEGF。
　　 本文首次用柞蠶絲素蛋白和PEI共同作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)傳遞載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，研究表明，與單純使用PEI相比，能有效提高轉(zhuǎn)染效率并降低細(xì)胞毒性，為組織工程