裝載促血管再生基因的絲素支架構(gòu)建及其對(duì)真皮再生的影響.pdf

1、促進(jìn)微血管再生，加快血管化速度，對(duì)于提高皮膚真皮再生支架的存活率至關(guān)重要。本文將含有核定位短肽的魚精蛋白(PS)偶聯(lián)到富含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)三肽序列和組氨酸(His)的柞蠶絲素蛋白(ASF)上，構(gòu)建同時(shí)具有細(xì)胞靶向性、內(nèi)涵體逃逸及細(xì)胞核定位多功能的可生物降解新型陽(yáng)離子化絲素(AP)。通過(guò)(AP+PEI)共包被和AP/ASF/PEI層層包被VEGF及Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒將質(zhì)粒pDNA負(fù)載到絲素支架上，得到裝載促血管

2、再生基因的絲素支架。利用(AP+PEI)共包被和AP/ASF/PEI層層包被基因載體傳遞促血管再生的VEGF165-Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒原位轉(zhuǎn)染細(xì)胞，促進(jìn)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞持續(xù)、局部地分泌VEGF、Ang-1等血管再生所需的生長(zhǎng)因子，加速支架的血管化速度，提高真皮再生支架的成活率。
　　首先，在EDC介導(dǎo)下，使柞蠶絲素蛋白的羧基與魚精蛋白的氨基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)生成酰胺鍵，建立對(duì)柞蠶絲素進(jìn)行陽(yáng)離子化改性的技術(shù)。測(cè)試顯示，當(dāng)柞蠶絲素與魚精蛋

3、白質(zhì)量比為100/10時(shí)，柞蠶絲素的Zeta電位從-5.2mV上升到+15.5mv，等電點(diǎn)pI從4.2變?yōu)?.7。當(dāng)AP/pDNA質(zhì)量比大于4/2時(shí)能將pDNA完全包裹，且復(fù)合物表面帶正電荷。
　　(AP+PEI)共包被法和AP/ASF/PEI層層包被法均能高效得包裹pDNA，并保護(hù)pDNA免受核酸酶的降解。(AP+PEI)/pDNA復(fù)合物表面Zeta電位為+20~+30mV，平均直徑分布為200~400nm。AP/ASF/PEI

4、/pDNA復(fù)合物表面Zeta電位分為+15~+25mV，平均直徑分布為400~600nm。(AP+PEI)共包被法和AP/ASF/PEI層層包被法均能介導(dǎo)質(zhì)粒pDNA成功轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞，并表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性。AP/ASF/PEI層層包被法的轉(zhuǎn)染效率略高于(AP+PEI)共包被法。
　　采用冷凍干燥法將(AP+PEI)/pDNA((30+10)/2)和AP/ASF/PEI/pDNA(45/45/10/2)

5、復(fù)合物裝載到絲素支架中，制備基因活性絲素支架。復(fù)合物在支架內(nèi)分散良好，細(xì)胞在該支架內(nèi)部正常粘附和生長(zhǎng)。(AP+PEI)/pDNA((30+10)/2)和AP/ASF/PEI/pDNA(45/45/10/2)復(fù)合物能成功將VEGF165-Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入目的細(xì)胞，導(dǎo)入的基因能正常地表達(dá)并分泌VEGF，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)VEGF分泌量顯著增多。該基因活性絲素支架體外能轉(zhuǎn)染雞胚尿囊膜上的細(xì)胞，并刺激其生成豐富的血管，且血管形態(tài)呈多分

6、支的彌漫放射狀，血管數(shù)目及大小都明顯高于未裝載基因活性物質(zhì)的絲素多孔材料組。
　　進(jìn)一步，將該絲素基因活性支架植入SD大鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該支架炎癥反應(yīng)輕微，能良好地與周圍組織融合。周圍組織及真皮修復(fù)細(xì)胞遷入材料內(nèi)部，支架可引導(dǎo)新生組織的長(zhǎng)入和毛細(xì)血管形成，并促進(jìn)表皮成活。隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，支架內(nèi)新生毛細(xì)血管和膠原纖維的生成量明顯比單純絲素多孔支架內(nèi)多。在創(chuàng)面修復(fù)早期，該基因活性支架內(nèi)VEGF、Ang-1、