?；摅w糖苷的生物合成及活性鑒定.pdf

1、天然產(chǎn)物的糖基化修飾在植物、動物和微生物中廣泛存在。通過對大分子生命物質(zhì)和小分子非生命物質(zhì)的糖基化及其后續(xù)的?；?、甲基化等修飾來調(diào)節(jié)生物體的生命活動。生物體中糖基化過程主要由不同類型及功能的糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)來完成，進(jìn)一步，在?；D(zhuǎn)移酶的作用下對糖苷?；男揎?，同時產(chǎn)生出多種多樣具有重要藥用價值的天然產(chǎn)物。藥物的糖基化及后續(xù)的修飾具有提高藥物活性、提高生物利用度、降低毒副作用等重要作用。
　　甾體類物質(zhì)普遍存在于生物體中，在植

2、物中主要以甾體糖苷和?；摅w糖苷形式存在。因甾體類型的不同、糖苷種類的變化以及糖基團(tuán)所連酰基種類及位置的不同而呈現(xiàn)出多種不同的形式。研究表明藥用植物桑多斯虎眼萬年青（Ornithogalum saundersiae）中含有多種乙?；摅w皂苷類物質(zhì)，如具有顯著抗癌活性的“OSW-1”，但由于含量稀少、提取復(fù)雜、合成困難嚴(yán)重阻礙了其進(jìn)一步研究。
　　本次研究從具有多種?；擒疹惢衔锏纳６嗨够⒀廴f年青（O.saundersiae）

3、中克隆得到19條糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因，利用其中甾體糖基轉(zhuǎn)移酶(SGT)基因作為生物合成工具來催化甾體類物質(zhì)得到甾體糖苷，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌中能夠催化甾體糖苷乙?；孽；D(zhuǎn)移酶(OGT)。以此設(shè)計(jì)乙?；摅w糖苷的生物合成方法，成功得到8種乙?；鶈熙；摅w糖苷并對其進(jìn)行了藥理活性篩選，結(jié)果顯示與未?；セ┑溺摅w糖苷相比抗癌活性明顯增強(qiáng)。
　　1、糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及大腸桿菌異源表達(dá)
　　提取桑多斯虎眼萬年青總mRNA，反

4、轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以轉(zhuǎn)錄組測序得到的序列信息設(shè)計(jì)引物，利用巢式PCR克隆得到19條糖基轉(zhuǎn)移酶基因(OsGT)。利用In-Fusion原理設(shè)計(jì)引物，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體。通過與分子伴侶共表達(dá)的方式進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了目的蛋白的可溶性表達(dá)。
　　2、糖基轉(zhuǎn)移酶的功能鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究
　　糖基轉(zhuǎn)移酶的底物有糖基供體和受體兩種，二者可與糖基轉(zhuǎn)移酶形成三元復(fù)合體，進(jìn)而進(jìn)行相應(yīng)的催化作用。通過將所得到的糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分

5、析，進(jìn)而確定主要的糖基供體和受體類型，分別利用49種不同類型的小分子天然產(chǎn)物作為糖基受體，選取UDP-Glc、UDP-Xyl、UDP-GlcA、UDP-Gal、UDP-GalA、UDP-Ara和UDP-GlcNAc7種糖基供體進(jìn)行受體和供體寬泛性研究。并進(jìn)一步通過HPLC、質(zhì)譜和NMR對所得糖基化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，最終確定了OsSGT1為甾體特異的糖基轉(zhuǎn)移酶。此外，通過對OsSGT1酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其最適的反應(yīng)

6、溫度為50℃，最適pH為9.0-11.0，并確定了重金屬離子的對其催化活性的影響。
　　3、甾體糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)與研究
　　在以大腸桿菌破碎液得到的糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶進(jìn)行底物糖基化修飾的反應(yīng)中，我們意外的得到了對應(yīng)的甾體糖苷乙?；a(chǎn)物。通過對大腸桿菌BL21(DE3)基因組進(jìn)行分析得到了3條“O-乙?；D(zhuǎn)移酶基因(OAT)”序列，通過設(shè)計(jì)引物，最終從大腸桿菌BL21(DE3)中克隆得到了3條O-乙?；D(zhuǎn)移酶：EOAT1、E

7、OAT2和EOAT3。通過進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建、蛋白表達(dá)和功能鑒定，發(fā)現(xiàn)EOAT2具有催化甾體糖苷乙?；墓δ堋４送?，我們還通過酶學(xué)實(shí)驗(yàn)對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。
　　4、乙?；溺摅w糖苷的生物合成及應(yīng)用
　　以甾體類化合物睪酮和雌二醇為底物，利用OsSGT1進(jìn)行糖基化反應(yīng)形成相應(yīng)的葡萄糖苷，即睪酮17β-O-β-D-葡萄糖苷和雌二醇17β-O-β-D-葡萄糖苷;然后，再通過乙?；D(zhuǎn)移酶(EOAT2)的催化作用，利用大腸桿菌內(nèi)源

8、或者外源添加乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)形成睪酮17β-O-β-D-葡萄糖苷-O-乙酰和雌二醇17β-O-β-D-葡萄糖苷-O-乙酰，以此合成途徑合成了不同糖苷位點(diǎn)乙?；膯熙；a(chǎn)物，通過對這些乙酰化的甾體糖苷進(jìn)行藥理活性篩選發(fā)現(xiàn)其具有增強(qiáng)了的抗人類肺癌細(xì)胞(NCI-H460)活性。
　　5、鯊烯合酶(OcSQS1)的研究
　　通過對虎眼萬年青（Ornithogalum caudatum）轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)分析，得到了全

9、長1230bp的鯊烯合酶unigene，進(jìn)一步通過ORF分析發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)為1044bp，命名為OcSQS1。將該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)OcSQS1為一種膜結(jié)合蛋白，其等電點(diǎn)是5.01，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)其屬于植物類SQS家族。為得到其原核可溶性表達(dá)并進(jìn)一步確定其功能，進(jìn)行了多種不同類型表達(dá)載體的構(gòu)建，蛋白表達(dá)純化，通過western-blot驗(yàn)證，進(jìn)一步通過體外酶促反應(yīng)后由HPLC、GC-MS檢測催化產(chǎn)物。最終以截去C-端膜結(jié)合區(qū)的突