羥基化甾體的生物合成.pdf

1、許多天然和半合成甾體化合物在醫(yī)藥領域和食品行業(yè)中占有重要地位。作為具有良好活性的藥用中間體，羥基化的甾體化合物天然含量稀少，提取繁瑣，化學合成困難，阻礙了對它們進一步的開發(fā)研究。尋找方法解決這類天然產物來源的問題顯得迫在眉睫，希望通過生物催化的方法解決上述難題。
　　細胞色素P450氧化酶是甾體羥基化酶的典型代表，尤其是來源于巨大芽孢桿菌的P450BM3。利用合成生物學的手段研究P450，可以以一種經濟又環(huán)保方式得到羥基化甾體中間

2、體。本論文主要論述了對細胞色素P450BM3突變體的功能鑒定和酶學性質探究，及對來源于植物虎眼萬年青的P450基因的克隆和表達，主要研究結果如下:
　　1.BM3突變體M01A82W、M01A82WS72I和M11A82W甾體底物特異性的研究
　　本實驗以13種甾體化合物作為探針研究三個具有代表性的BM3突變體M01A82W、M01A82WS72I和M11A82W的底物特異性。酶促催化結果顯示只有3-keto-Δ4-ster

3、oids結構的睪酮、甲睪酮、黃體酮、17α-OH黃體酮和雄烯二酮可以被羥基化得到不同位點和不同構型的化合物，而其他8種3-hydro-Δ5-steroids不能被羥基化。結果表明pET28aM0182、M018272和M1182酶可能更偏愛3-keto-Δ4-steroids底物。
　　2.BM3突變體139-3催化甾體羥基化
　　本研究以BM3139-3及其突變體為生物催化劑篩選13種甾體底物，并對其進行深入的酶學性質研究

4、，以期擴大其底物譜。酶促催化結果顯示，139-3能夠在1α位特異性將雄烯二酮羥基化為1α-OH-雄烯二酮。為了能夠工業(yè)化應用BM3突變體139-3催化C-1α羥化反應，進行催化條件（反應溫度，反應時間，pH和底物濃度）的優(yōu)化。研究結果表明BM3突變體139-3在37℃，pH7.0反應4小時，能獲得雄烯二酮37％的最高轉化率。此外，為了提高139-3酶活性和擴大底物范圍，對139-3進行隨機突變。測序結果表明139-3共有5個位點發(fā)生突變

5、，得到4個突變體，并且所有突變體在379位氨基酸處發(fā)生突變，導致R379S，而且失去了對雄烯二酮的羥基化活性。研究表明位于379位的精氨酸殘基在139-3的羥基化活性中起關鍵作用。
　　3.虎眼萬年青中P450基因的克隆和表達
　　提取虎眼萬年青無菌組織的總RNA，逆轉錄得到cDNA。依據虎眼萬年青轉錄組序列，設計引物，利用巢式PCR克隆得到3條細胞色素P450氧化酶基因（Os5155、Os813和Os9107)。利用In-