D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的表達(dá)及其固定化轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖的研究.pdf

1、D-阿洛酮糖是一種新型低熱量的功能性因子，D-果糖的差向異構(gòu)體，在自然界存在極少，可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和保健等領(lǐng)域。D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-psicose3-epimerase，縮寫為DPE)是一種可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖進(jìn)行可逆反應(yīng)的胞內(nèi)異構(gòu)化酶。鑒于D-阿洛酮糖多應(yīng)用于食品領(lǐng)域，本文選用食品級(jí)微生物枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為表達(dá)宿主。本文構(gòu)建了高效表達(dá)來(lái)源于Clostridiumcellulo

2、lyticumH10的DPE基因(CCDPE)以及來(lái)源于Ruminococcussp.的DPE基因(RDPE)的重組枯草芽孢桿菌工程菌株。研究了CCDPE在重組枯草芽孢桿菌中的表達(dá)與純化、酶學(xué)性質(zhì)、酶的固定化以及與兩種重組酶的理化性質(zhì)比較等方面的內(nèi)容。
　　來(lái)源于ClostridiumcellulolyticumH10的DPE基因片段大小約為882bp，蛋白分子量約為33kDa。用LB-Kana培養(yǎng)基（Kana含量50μg/mL）

3、在37℃、200rpm條件下培養(yǎng)重組菌株，收獲菌體后經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎儀破碎、離心收集上清液，用Ni-NTA親和層析柱和Source15Q陰離子交換柱提純目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果表明，目的蛋白為可溶性表達(dá)，條帶特異性強(qiáng)，純化效果較為理想，純度可以達(dá)到90％以上。純化的CCDPE酶酶學(xué)性質(zhì)研究表明，其最適溫度50℃、最適pH8.0，其活性不依賴金屬離子，但Co2+對(duì)其有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用，酶促動(dòng)力學(xué)反應(yīng)結(jié)果表明，該酶對(duì)D-阿洛酮糖具有較高

4、的底物特異性。
　　本文還采用了不同載體材料和固定方法對(duì)CCDPE粗酶固定化工藝影響的研究，綜合得出，以殼聚糖為載體固定CCDPE粗酶效果比較好，在對(duì)固定化工藝條件優(yōu)化后得出當(dāng)固定時(shí)間為3h，[酶]∶[載體]=15∶1(U/g)時(shí)酶活回收率最高為45％。另外，本文也采用此固定化方法對(duì)枯草芽孢桿菌中表達(dá)的Ruminococcussp.的DPE粗酶進(jìn)行固定化研究。對(duì)CCDPE自由酶、CCDPE固定化酶、RDPE自由酶和RDPE固定化酶

5、的最適pH、最適溫度以及金屬離子等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，對(duì)CCDPE而言，其固定化酶的最適溫度(55℃)和pH(8.5)都高于自由酶(50℃、8.0);對(duì)RDPE而言，其固定化酶的最適溫度較自由酶相比沒有明顯改變，均為60℃，但其固定化酶的pH(9.0)高于自由酶(8.0);Ni2+、Cu2+和Zn2+均對(duì)CCDPE自由酶與固定化酶以及RDPE自由酶與固定化酶酶活性有抑制作用，Co2+和Mn2+對(duì)CCDPE自由酶酶活性有強(qiáng)烈的促進(jìn)