大視場超分辨定位顯微成像方法研究.pdf

1、近年來,超分辨定位顯微成像憑借其約20nm的超高空間分辨率成為細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)及神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域前所未有的工具。在保證該技術(shù)的超高空間分辨率的同時,若能大大提高成像視場,將對細(xì)胞通訊與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)理研究,如神經(jīng)回路連接成像等,具有重要的推動作用。遺憾的是,現(xiàn)有的超分辨定位顯微成像的視場較小,制約了它的應(yīng)用范圍。因此,本文圍繞超分辨定位顯微成像中空間分辨率、時間分辨率與成像視場的相互制約關(guān)系,分別從如下四個部分展開了研究:

2、>　　(1)超分辨定位顯微成像中空間分辨率的決定因素。分析了信號的散粒噪聲、像素化噪聲和背景噪聲的理論模型,并通過仿真和實驗,對現(xiàn)有理論模型的準(zhǔn)確性和適用范圍進(jìn)行評估。結(jié)果表明,在生物成像的條件下,現(xiàn)有弱光探測器的背景噪聲模型需要修正,以適應(yīng)背景噪聲與像素尺寸的平方成正比的特征。另外,我們發(fā)現(xiàn),在一定信號(850photons)與背景(3150photon/μm2)水平下,若要定位精度達(dá)到20nm,超分辨定位顯微成像的最佳像素尺寸為80

3、nm。
　　(2)超分辨定位顯微成像中成像視場的決定因素。針對一定時空分辨率下的視場提升要求,對照明模塊及探測模塊需求進(jìn)行分析。結(jié)果表明:大視場照明需要采用全內(nèi)反射照明、高入射角照明及高功率光源;而大視場探測則需要高收集效率的光學(xué)元件,以及具有高幀頻、大像素元陣列的高性能弱光探測器。
　　(3)基于sCMOS相機(jī)的超分辨定位成像方法。分析了各種噪聲源在單分子成像總噪聲中的權(quán)重,結(jié)果表明:在使用sCMOS相機(jī)和信號較強的熒光探

4、針(如d2EosFP)條件下,超分辨定位顯微成像的主要噪聲來源于信號的散粒噪聲。實驗演示了sCMOS相機(jī)對細(xì)胞骨架微絲的超分辨成像,證明了sCMOS相機(jī)能夠應(yīng)用到超分辨定位顯微成像中。
　　(4)大視場超分辨定位顯微成像的初步實現(xiàn)?；趕CMOS相機(jī)的并行數(shù)據(jù)讀出優(yōu)勢,我們初步實現(xiàn)了大視場超分辨定位顯微成像,其視場得到顯著增大(210x185μm2,約40倍提升)。另外,通過研究空間分辨率與成像幀數(shù)之間的關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn),可以在保證