特異腐質(zhì)霉H31-3纖維二糖水解酶基因克隆與表達(dá).pdf

1、目的:纖維素是地球上數(shù)量最多的可再生資源。它具有穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu),不易被降解。隨著糧食短缺,能源危機(jī)和環(huán)境污染的日益嚴(yán)重,如何合理的利用現(xiàn)存的大量的纖維素供能,成為人們關(guān)注的問題。
　　 纖維素酶是一種催化纖維素分解的酶。用纖維素酶分解纖維素具有高效、方便、副產(chǎn)品少等優(yōu)勢(shì),成為研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)很多生物都產(chǎn)生纖維素酶,如細(xì)菌、放線菌、真菌、昆蟲等。其中真菌因產(chǎn)生的纖維素酶種類多,活力高而受到人們的關(guān)注。維素酶分為三種類型:內(nèi)切葡

2、萄糖苷酶(EG),纖維二糖水解酶(CBH),β-葡萄糖苷酶(BG)。
　　 國內(nèi)纖維素酶的產(chǎn)量較低,大部分需要進(jìn)口。人們利用多種方法來提高纖維素酶的產(chǎn)量和活力。傳統(tǒng)的菌種選育和幾種酶的混合搭配,對(duì)酶的催化作用提高不大。將基因工程的方法應(yīng)用于酶學(xué)領(lǐng)域,對(duì)纖維素酶的研究向前推進(jìn)一步。例如:人們用活性位點(diǎn)突變的方法,改變酶蛋白的折疊,來提高酶的活性。人們也將纖維素酶的基因轉(zhuǎn)入到工程菌中進(jìn)行表達(dá),以提高它的產(chǎn)量。目前使用的工程菌有很多,

3、如大腸桿菌、釀酒酵母菌、畢赤酵母菌等等。其中,畢赤酵母菌表達(dá)真核蛋白具有產(chǎn)量高、易培養(yǎng)、對(duì)蛋白的修飾與真核生物相似等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用。
　　 中科院微生物所在1970年從腐殖土里分離得到了一株特異腐質(zhì)霉H31-3。該菌產(chǎn)生的中性纖維素酶耐高溫,且有較廣的PH值穩(wěn)定性,非常適用于工業(yè)生產(chǎn)。石家驥老師等,對(duì)該菌進(jìn)行了突變,使它的產(chǎn)酶量和活力進(jìn)一步提高。該實(shí)驗(yàn)室將突變后特異腐質(zhì)霉產(chǎn)生的三種主要的纖維素酶進(jìn)行了純化和質(zhì)譜分析。質(zhì)

4、譜結(jié)果顯示,突變后的特異腐質(zhì)霉分泌cbh2蛋白與灰色腐質(zhì)酶熱變種產(chǎn)生的纖維二糖水解酶O93780具有相同的氨基酸序列。由于,真菌產(chǎn)生的纖維素酶基因的同源性較高,在纖維素酶催化區(qū)和纖維素結(jié)合區(qū)的核苷酸序列保守性很強(qiáng)。不能僅由質(zhì)譜結(jié)果確定這兩個(gè)蛋白相同。另外,具有相同氨基酸的蛋白,如果來自于不同的菌株,可能會(huì)有不同的基因型.因此,為了對(duì)cbh2進(jìn)行開發(fā),首先要確定突變后特意腐質(zhì)霉cbh2的基因,再將cbh2表達(dá),獲得大量的分泌型cbh2蛋白

5、。本實(shí)驗(yàn)的目的是確定特異腐質(zhì)酶H31-3 cbh2的基因,再將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌中進(jìn)行表達(dá)和分泌。
　　 方法:
　　 1.確定特突變后異腐質(zhì)霉的H31-3cbh2基因序列
　　 1.1部分cbb.2基因片段的克隆
　　 先提突變后的特意腐質(zhì)霉基因組DNA,依據(jù)cbh2的質(zhì)譜結(jié)果中與O93780相似的氨基酸序列設(shè)計(jì)引物P1和P2。擴(kuò)增出長(zhǎng)約500bp的基因片段。膠回收、測(cè)序,用BLAST軟件與報(bào)道的O937

6、80基因比對(duì)。測(cè)序結(jié)果與O93780的部分基因片段相同。
　　 1.2 cbh2基因全長(zhǎng)的克隆并與O93780基因進(jìn)行比對(duì)
　　 依據(jù)報(bào)道的O93780全基因序列設(shè)計(jì)引物P3和P4,擴(kuò)增出長(zhǎng)約1500bp的基因片段。膠回收,連接到pEASY-T載體上,將該重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸感受態(tài)中擴(kuò)增。用含有青霉素的LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子,將長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子小量培養(yǎng),提質(zhì)粒,用P3和P4引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,將驗(yàn)證為陽性的質(zhì)粒測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與O

7、93780的全基因序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示,測(cè)序結(jié)果與O93780全的基因序列完全相符。
　　 2.構(gòu)建兩種分泌型的表達(dá)載體,一是帶有載體自身信號(hào)肽的pGAPZαA-cbh2 cDNA,一是帶有cbh2蛋白自身信號(hào)肽的pGAPZA-cbh2 cDNA2
　　 2.1特異腐質(zhì)霉總RNA的提取
　　 2.2無蛋白自身信號(hào)肽的cbb2 cDNA和帶自身信號(hào)肽的cbh2 cDNA2的克隆
　　 依據(jù)NCBI報(bào)道的O

8、93780去信號(hào)肽的基因序列,設(shè)計(jì)引物P5和P6,其中P5去掉O93780前面的24個(gè)氨基酸信號(hào)肽,并加上EcoR1酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。P6加上Not1酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。用RT-PCR的方法得到了去掉信號(hào)肽的cbh2 cDNA。帶有信號(hào)肽的cbh2 cDNA2用P7和P6為引物,用RT-PCR的方法合成。
　　 2.3將重組載體pEASY-T-cbh2 cDNA和pEASY-T-cbb.2 cDNA2轉(zhuǎn)入大腸感受態(tài)中進(jìn)行擴(kuò)

9、增
　　 將上述RT-PCR產(chǎn)物膠回收與pEASY-T連接,形成重組質(zhì)粒pEASY-T-cbh2 cDNA和pEASY-T-cbh2 cDNA2,將上述兩種重組質(zhì)粒用化學(xué)方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。用含有青霉素的LB培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子,將長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小量培養(yǎng),分別用兩對(duì)引物P7、P6和P5、P6,進(jìn)行PCR,鑒定cbh2 cDNA和cbh2 cDNA2,將鑒定為陽性的質(zhì)粒測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與O93780的基因序列比對(duì),確定兩種cbh2

10、 cDNA的擴(kuò)增的正確性。
　　 2.4構(gòu)建兩種分泌型的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸感受態(tài)中擴(kuò)增
　　 分別將測(cè)序正確的cbh2 cDNA、cbh2 cDNA2與pGAPZaA和pGAPZA載體用EcoR1和Not1雙酶切,連接,以化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸感受態(tài)中擴(kuò)增。用帶有Zeocin抗性的LB平板篩菌。將長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小量培養(yǎng),提質(zhì)粒,用兩對(duì)引物(P5和P6;P7和P6)進(jìn)行PCR驗(yàn)證,將驗(yàn)證為陽性的質(zhì)粒送去測(cè)序,

11、測(cè)序引物為a-factor和3-AOX。將
　　 2個(gè)測(cè)序結(jié)果與O93780 cDNA核苷酸序列比對(duì),確定cbh2 cDNA和cbh2cDNA2在表達(dá)載體pGAPZA和pGAPZaA中的插入是否正確。
　　 3將重組正確的pGAPZaA-cbh2 cDNA與pGAPZA-cbh2 cDNA2轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌中進(jìn)行分泌
　　 3.1制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞
　　 3.2將重組質(zhì)粒pGAPZaA-cbh2 cDN

12、A與pGAPZA-cbh2 cDNA2用BspH1線性化
　　 3.3將上述線性化產(chǎn)物以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中,用含有Zeocin抗性的YPD平板進(jìn)行篩選。將轉(zhuǎn)化子用YPD培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),提畢赤酵母的基因組DNA,用兩對(duì)P5和P6;P7和P6,以PCR的方法來驗(yàn)證cbh2 cDNA及cbh2 cDNA2是否整合到畢赤酵母基因組染色體上。并以a-factor和3-AOX為引物測(cè)序驗(yàn)證整合是否正確。
　　 3.

13、4驗(yàn)證cbh2蛋白分泌
　　 將整合有外源基因的畢赤酵母在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí),收集上清粗酶液,用SDS-PAGE方法確定粗酶液中是否有特異的蛋白條帶產(chǎn)生,觀察特異性條帶的大小,并將特異性條帶切下來,做質(zhì)譜分析。
　　 3.5測(cè)定畢赤酵母中分泌的上述cbh2蛋白的最適溫度,最適PH和溫度穩(wěn)定性
　　 4.用甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母菌cbh2的表達(dá)
　　 將整合有pGAPZaA-cbh2 cDNA的畢赤酵母菌

14、接種于BMGY培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至菌密度OD600=3,收集菌體轉(zhuǎn)接于BMMY培養(yǎng)集中,用1％甲醇誘導(dǎo)表達(dá),測(cè)定分泌蛋白的活性。
　　 結(jié)果:
　　 1突變特異腐質(zhì)霉cbh2與灰色腐質(zhì)霉熱變種O93780有相同的核苷酸序列,這兩種蛋白具有相同的基因。
　　 2成功在畢赤酵母菌中表達(dá)了特變特意腐質(zhì)霉分子量為55KD的H31-3cbh2
　　 3蛋白自身的信號(hào)肽不能將cbh2分泌到胞外,載體的信號(hào)肽可以將cbh2蛋

15、白分泌到胞外。在BMMY培養(yǎng)基中,用1％的甲醇誘導(dǎo)cbh2蛋白表達(dá)失敗。
　　 4畢赤酵母菌分泌的cbh2蛋白其最適PH值為8,最適溫度為70℃。在50℃保存12小時(shí)后,酶活依舊有65％。
　　 結(jié)論:
　　 1突變特異腐質(zhì)霉(H31-3)cbh2與灰色腐質(zhì)霉熱變種O93780有相同基因。
　　 2在畢赤酵母菌中表達(dá)了最適PH為8,最適溫度為70℃,分子量為55KD的可分泌的突變特異腐質(zhì)霉H31-3 cb