發(fā)菜中麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆及其在脅迫條件下的響應(yīng).pdf

1、發(fā)菜是一種極端環(huán)境下生長的陸生藍(lán)藻,對逆境具有極強(qiáng)的適應(yīng)力,因此是抗逆性研究中一種典型的植物資源,對其抗逆性研究具有重要的意義。目前人們對發(fā)菜適應(yīng)極端環(huán)境的研究已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注,但是還沒有突破性的進(jìn)展。本研究以發(fā)菜這一具有很強(qiáng)抗逆性的絲狀藍(lán)藻作為研究材料,應(yīng)用基因工程技術(shù),從發(fā)菜中克隆得到合成海藻糖途徑的一個重要酶:麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTH,轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá),并對蛋白進(jìn)行了純化和酶活測定。同時,通過干旱和鹽脅迫發(fā)菜,

2、檢測其MTS和MTH酶的表達(dá)量及相同條件下海藻糖和蔗糖的含量情況。得到以下結(jié)果和結(jié)論:
　　 首先通過設(shè)計(jì)簡并引物,從發(fā)菜(Nostoc flaglliforme)中克隆出MTH的基因TreZ,對該基因序列測序表明開讀框全長1848 bp,編碼的蛋白質(zhì)有615個氨基酸。
　　 通過生物信息學(xué)分析得到該基因編碼的氨基酸序列包含四個麥芽寡糖基海藻糖水解酶的高度保守區(qū)域。將該基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),通過SDS-PAGE檢測到

3、在0.5 mM IPTG誘導(dǎo)條件下該基因在大腸桿菌中有很高的表達(dá)量,分子質(zhì)量約為70 kD。所得的重組蛋白經(jīng)過純化后,用麥芽六糖作為底物進(jìn)行酶活反應(yīng),能水解麥芽四糖海藻糖為海藻糖。
　　 在干旱和鹽脅迫下,發(fā)菜中的海藻糖和蔗糖的積累量都顯著升高,同時麥芽糖基海藻糖水解酶和合成酶的表達(dá)量也呈現(xiàn)增加的趨勢。
　　 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功地從發(fā)菜中克隆到預(yù)測的麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTH的基因TreZ,并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),