重組大腸桿菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的高密度發(fā)酵研究.pdf

1、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(蛋白質(zhì)-谷氨酸-γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,Transglutaminase EC2.3.2.13,TGase),是一種催化?；D(zhuǎn)移反應的酶,它以肽鏈中的谷氨酰胺殘基γ-酰胺基作為?；w,當?；荏w為多肽中賴氨酸殘基的ε-氨基或伯氨基時,它催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)、蛋白質(zhì)、氨基酸、肽鏈之間的連接;當水為?；荏w時,可催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解。由于TGase具有提高各種蛋白的功能特性的巨大潛能,主要應用于提高蛋白的

2、質(zhì)地和穩(wěn)定性。
　　本文以大腸桿菌Rosetta(DE3)為研究對象,以提高菌體濃度為目標,對重組菌的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組分進行了優(yōu)化研究。在合成培養(yǎng)基的基礎上,進行了10L發(fā)酵罐小試,并對得到的包涵體蛋白進行溶解、變性、最終得到具有生物活性的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。
　　為了提高重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的產(chǎn)量,在搖瓶發(fā)酵條件下,采用LB培養(yǎng)基對大腸桿菌Rosetta(DE3)的生長及產(chǎn)物表達進行了初步研究,確定了最佳的發(fā)酵條件:搖瓶裝液量

3、為25mL/250mL,接種量為5％,培養(yǎng)溫度為37℃,初始pH7.0,接種4h后(對數(shù)中期,OD=0.6～0.8)進行誘導,誘導劑濃度為0.8mmol/L,誘導持續(xù)時間為4h。
　　在上述發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎上,通過一系列單因子試驗及正交實驗對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化,最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖4g/L,酵母提取物3g/L,NH4Cl4.0g/L,Na2HPO42.0g/L,KH2PO41.0g/L,MgSO4·7H2O1.0g/

4、L,NaCl3.0g/L,微量元素溶液濃度2.0mL/L,鹽酸硫胺素(VB1)1.0mg/L、核黃素(VB2)0.5mg/L、泛酸(VB5)0.5mg/L、鹽酸吡哆醇(VB6)0.2mg/L。采用此合成培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵,最終的OD由1.8提高到5.8左右,重組蛋白的表達量可達36.2％。菌體生長率和菌體濃度都得到大幅度的提高。
　　在以上研究的基礎上,采用溶氧反饋流加補料策略,對其進行10L發(fā)酵小試,最終OD達到51.5,將發(fā)酵