重組大腸桿菌高密度發(fā)酵表達(dá)類人膠原蛋白過程代謝通量分析及優(yōu)化.pdf

1、本研究考察了Escherichia coli BL 21菌株生產(chǎn)類人膠原蛋白的培養(yǎng)過程。通過代謝流分析的手段，討論了不同生長時期，不同比生長速率下代謝流分布的狀況以及能量和還原力的產(chǎn)生和分布狀況，確定了誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后最適合細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)的培養(yǎng)條件，結(jié)果表明： 1．在誘導(dǎo)前的補料培養(yǎng)階段，比生長速率為0.16 h<'-1>時，紐胞進入PP途徑(R<,1>)的通量最高，用于細(xì)胞合成的通量也最大。同時當(dāng)細(xì)胞比生長速率由0.16 h

2、<,-1>增到0.25 h<,1>時，異檸檬酸生成(R<,14>)的通量只增加了0.87％和1.04％；而乙酸生成途徑(OA)的通量卻增長了110％和25％，可以認(rèn)為是控制碳流進入TCA循環(huán)的檸檬酸合成酶在比生長速率為0.16 h<,-1>時就已經(jīng)接近于飽和狀態(tài)。從而確定誘導(dǎo)前較小的比生長速率有利于細(xì)胞的生長。 2．當(dāng)升溫誘導(dǎo)后，比生長速率為0.05 h<,-1>時，流向PP途徑的通量最高，且在此種培養(yǎng)條件下，無論是流向細(xì)胞合成

3、或是目標(biāo)產(chǎn)物的前體通量都是最大。另外，當(dāng)比生長速率由0.05調(diào)整到0.07 h<,-1>時，從乙酰輔酶A流向異檸檬酸的通量只增大了7％，而從乙酰輔酶A流向乙酸的通量增加了29％，由此可以說明當(dāng)比生長速率達(dá)到0.05 h<,-1>后檸檬酸合成酶就基本上達(dá)到了飽和狀態(tài)。這就進一步證明了μ=0.05 h<,-1>在4種條件下最有利于細(xì)胞和目標(biāo)產(chǎn)物的合成。 3．誘導(dǎo)前，用于細(xì)胞合成的 ATP 消耗速率在3種培養(yǎng)條件下遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于m<,ATP

4、>，這說明隨著比生長速率的增加，細(xì)胞將合成的大量ATP用于維持代謝等，但ATP產(chǎn)生速率的增加對細(xì)胞合成的貢獻(xiàn)卻不大。 4．誘導(dǎo)后隨著補糖速率和比生長速率的增加，用于生長無關(guān)的ATP消耗速率依次增加，m<,ATP>從μ=0.02 h<'-1>到，μ=0.04h<'-1>增加了21.3％；而從,μ=0.04 h<'-1>到，μ=0.05h<'-1>增加了9.6％；最后從μ=0.05 h<'-1>到μ=0.07 h<-1>增加了37.