蛋白質(zhì)分子大幅度構(gòu)象變化的計(jì)算模擬研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是生物體各種生理過程的主要執(zhí)行者。在生理?xiàng)l件下，不同蛋白質(zhì)特定序列的氨基酸長(zhǎng)鏈能夠折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)，行使其生理功能。因此漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程必然使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)具有功能意義。隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定技術(shù)的日益成熟，越來越多的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)被解析出來，這些結(jié)構(gòu)信息揭示了很多重要生理過程的分子機(jī)制，也為藥物的研制提供了關(guān)鍵的理論基礎(chǔ)。然而，隨著當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物物理化學(xué)的逐步深入發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)僅有蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的信息往往不足以理解其生物學(xué)功能

2、。這是因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)解析給出的是單一的一個(gè)靜態(tài)結(jié)構(gòu)(如晶體結(jié)構(gòu))，而蛋白質(zhì)在行使其生理功能時(shí)往往會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，產(chǎn)生一系列瞬態(tài)構(gòu)象。換言之，溶液中的蛋白質(zhì)作為一種軟物質(zhì)可以在其平衡構(gòu)象附近振蕩，甚至可以遠(yuǎn)離平衡構(gòu)象，而晶體結(jié)構(gòu)得到的只是蛋白質(zhì)勢(shì)能面上的一個(gè)點(diǎn)。要全面理解蛋白質(zhì)的功能和揭示生理過程的分子機(jī)制我們不但需要了解蛋白質(zhì)的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，更需要了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)柔性和各個(gè)瞬態(tài)構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)換，即動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。因此需要在傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中加入時(shí)間

3、的維度，將結(jié)構(gòu)一功能關(guān)系擴(kuò)展到結(jié)構(gòu)-動(dòng)力學(xué)-功能關(guān)系的研究。蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)行為的時(shí)間尺度很寬，其涵蓋范圍從快速而局部性的原子波動(dòng)到慢速而整體性的諸如蛋白質(zhì)折疊的構(gòu)象變化。許多蛋白質(zhì)分子實(shí)現(xiàn)其生物功能時(shí)都需要發(fā)生大幅度的構(gòu)象變化，比如通過線團(tuán)(loop)結(jié)構(gòu)的擺動(dòng)和二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)對(duì)活性位點(diǎn)構(gòu)象的調(diào)整或者對(duì)底物分子進(jìn)行識(shí)別，這類運(yùn)動(dòng)的時(shí)間尺度大致在納秒到微秒(10-9到10-6秒)級(jí)別，運(yùn)動(dòng)幅度一般在1到5 A。更復(fù)雜的運(yùn)動(dòng)則往往需要

4、通過結(jié)構(gòu)域的整體運(yùn)動(dòng)來完成，這種結(jié)構(gòu)域間的相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)和平動(dòng)的時(shí)間尺度大致在微秒到毫秒(10-6到10-3秒)級(jí)別，運(yùn)動(dòng)幅度一般會(huì)達(dá)到5到10 A左右。各時(shí)間尺度上的運(yùn)動(dòng)從原子振動(dòng)到大幅度的蛋白整體運(yùn)動(dòng)會(huì)發(fā)生相互耦合，使得對(duì)蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)和功能關(guān)系的研究變得越發(fā)復(fù)雜。
　　和實(shí)驗(yàn)手段相比，計(jì)算機(jī)模擬方法在研究蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。只要有一個(gè)高精度的蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)作為起點(diǎn)，計(jì)算方法就能夠“全面”地描述蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)(以分子動(dòng)力學(xué)

5、模擬為代表)，我們可以跟蹤單個(gè)蛋白質(zhì)分子在每個(gè)時(shí)刻每個(gè)原子的精確位置和相應(yīng)的能量。盡管蛋白質(zhì)不同的構(gòu)象狀態(tài)和它們之間的轉(zhuǎn)換速率可以通過實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)，但是對(duì)構(gòu)象之間轉(zhuǎn)換路徑上各個(gè)狀態(tài)的高精度描述卻是實(shí)驗(yàn)無法達(dá)到的，因?yàn)檫@些狀態(tài)都是壽命很短，出現(xiàn)幾率很低的高能構(gòu)象。計(jì)算方法則可以克服這些局限。另一方面，計(jì)算機(jī)模擬中包含了體系粒子之間的所有相互作用力和相應(yīng)的能量，因此盡管實(shí)驗(yàn)方法可以告訴我們蛋白質(zhì)怎樣運(yùn)動(dòng)，計(jì)算方法卻可以告訴我們蛋白質(zhì)為什么這

6、樣運(yùn)動(dòng)。目前計(jì)算方法的主要缺陷是傳統(tǒng)的分子動(dòng)力學(xué)方法能夠模擬的動(dòng)力學(xué)時(shí)間尺度是皮秒到納秒范圍，對(duì)蛋白質(zhì)的一些慢速(微秒到毫秒)構(gòu)象變化過程的模擬則非常困難。為了克服這一困難，計(jì)算生物學(xué)家發(fā)展了多種方法和策略來簡(jiǎn)化力場(chǎng)或施加外力以加速構(gòu)象變化過程。
　　我們選取了三個(gè)大小構(gòu)造不一但都能夠發(fā)生大尺度構(gòu)象變化的蛋白質(zhì)體系來研究結(jié)構(gòu)單元和構(gòu)象變化之間的關(guān)系。這些體系包括含有四個(gè)結(jié)構(gòu)域的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白輸入體BtuCD和輸出體MsbA、PS

7、D-95蛋白中含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的串列體PDZ12以及脂質(zhì)化修飾的膜融合SNARE蛋白Ykt6。在實(shí)際應(yīng)用過程中，除了常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬之外我們也使用了靶向分子動(dòng)力學(xué)模擬和正則模式分析的方法，分別通過外加力場(chǎng)加速構(gòu)象變化以及分析局域勢(shì)能面形態(tài)的方式來獲得蛋白質(zhì)體系大幅度構(gòu)象變化的信息。
　　ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白超家族在生物體中能夠利用筒ATP分子結(jié)合和水解的能量實(shí)現(xiàn)底物分子跨細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。轉(zhuǎn)運(yùn)的過程需要發(fā)生大幅度的構(gòu)象變化，在面向內(nèi)(in

8、ward-facing)構(gòu)象(孔道向內(nèi)打開向外關(guān)閉)和面向外(outward-facing)構(gòu)象(孔道向內(nèi)關(guān)閉向外打開)之間切換。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白由兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域與兩個(gè)核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，其運(yùn)作的核心機(jī)制在于其跨膜結(jié)構(gòu)域與核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域的運(yùn)動(dòng)耦合。前者內(nèi)部底物轉(zhuǎn)運(yùn)孔道的開閉和后者在ATP分子的結(jié)合和水解時(shí)表現(xiàn)出的二聚和解離貫穿著整個(gè)底物轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。就此，我們以BtuCD輸入體和MsbA輸出體為研究對(duì)象采用了正則模式分析和靶向分子動(dòng)力學(xué)模

9、擬的方法進(jìn)行了研究。
　　維生素B12輸入體BtuCD蛋白具有20個(gè)跨膜螺旋，孔道的大部分由一對(duì)。TM5螺旋組成，而跨膜結(jié)構(gòu)域則通過L線團(tuán)結(jié)構(gòu)與核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連。我們發(fā)現(xiàn)不論是從面向外到面向內(nèi)還是從面向內(nèi)到面向外的構(gòu)象變化過程，核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域的運(yùn)動(dòng)總會(huì)通過L線團(tuán)與轉(zhuǎn)運(yùn)孔道細(xì)胞內(nèi)側(cè)端的運(yùn)動(dòng)同步進(jìn)行。在從面向外構(gòu)象到面向內(nèi)構(gòu)象的變化中，核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域的打開會(huì)導(dǎo)致L線團(tuán)的打開，繼而引起孔道主體TM5螺旋細(xì)胞內(nèi)側(cè)端的打開。其逆過程也基本

10、相似。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)正逆向的變化過程并沒有經(jīng)歷同一條構(gòu)象轉(zhuǎn)化路徑，而是存在著一定的差異。在正方向過程中，TM5螺旋內(nèi)側(cè)端會(huì)平穩(wěn)地經(jīng)由對(duì)稱運(yùn)動(dòng)的方式打開，而逆方向過程則往往會(huì)有一段更明顯的非對(duì)稱運(yùn)動(dòng)階段。我們的研究揭示了BtuCD蛋白各個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化之間的耦合關(guān)系，給出了BtuCD輸入體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的詳細(xì)圖像，并特別指出了從面向內(nèi)到面向外的變化過程會(huì)經(jīng)歷一個(gè)非對(duì)稱的中間狀態(tài)。
　　MsbA蛋白是細(xì)菌中脂質(zhì)A和脂多糖分子的輸出體。它與

11、多類藥物抗性蛋白P糖蛋白序列高度同源且結(jié)構(gòu)相似，對(duì)它的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的研究將為癌癥治療藥物的設(shè)計(jì)提供直接的參考依據(jù)。通過研究其面向外到面向內(nèi)的構(gòu)象變化過程我們?cè)俣茸C實(shí)了核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域的耦合機(jī)制，但其具體的構(gòu)象變化過程與BtuCD體系完全不同。核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域的打開變化首先會(huì)經(jīng)過序列高度保守的X線團(tuán)抵達(dá)孔道細(xì)胞內(nèi)側(cè)端的四螺旋束，然后隨著四螺旋束的打開再經(jīng)由跨膜螺旋TM6將細(xì)胞內(nèi)側(cè)的變化情況向細(xì)胞外側(cè)傳遞。在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中各結(jié)構(gòu)單元緊密配合

12、，由核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域開始經(jīng)由X.線團(tuán)、四螺旋束以及跨膜螺旋TM6直到細(xì)胞外側(cè)端，這些結(jié)構(gòu)單元共同參與了整個(gè)變化過程。這一系列過程也首次指出了在輸出體蛋白中序列高度保守的X線團(tuán)在傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化方面的重要作用。對(duì)MsbA構(gòu)象變化過程的研究證實(shí)了長(zhǎng)期以來人們關(guān)于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的一個(gè)假設(shè)，即蛋白質(zhì)的大范圍構(gòu)象變化是由核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化引發(fā)的，而構(gòu)象變化信號(hào)在結(jié)構(gòu)域之間的傳遞呈現(xiàn)出清晰的時(shí)間空間順序。
　　與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋

13、白相比，PSD-95蛋白的N端PDZ12串列體的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單。它含有兩個(gè)球狀的PDZ結(jié)構(gòu)域PDZ1和PDZ2，之間通過一段序列保守的五肽連接片段串列而成。兩個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域都能夠特異性地與目標(biāo)蛋白的C末端結(jié)合，作為信號(hào)傳導(dǎo)、膜受體集聚以及細(xì)胞極性維持等生理過程中的重要一環(huán)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在未結(jié)合肽段時(shí)，PDZ12串列體的兩個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域之間的取向相對(duì)固定，而在結(jié)合肽段之后則不再具有這種固定取向。這預(yù)示著PDZ12串列體在結(jié)合肽段后發(fā)生了大幅度

14、的構(gòu)象變化。我們利用分子動(dòng)力學(xué)模擬直接比較了無肽段結(jié)合狀態(tài)和肽段結(jié)合狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12納秒的模擬很好地表現(xiàn)出肽段結(jié)合對(duì)PDZ1和PDZ2結(jié)構(gòu)域之間相對(duì)運(yùn)動(dòng)的影響。無底物結(jié)合態(tài)PDZ12的PDZ結(jié)構(gòu)域相對(duì)取向夾角的取值范圍較小，約有50°，相比之下，肽段結(jié)合后夾角的擺動(dòng)幅度可以達(dá)到150°。也就是說，肽段的結(jié)合加大了PDZ結(jié)構(gòu)域相對(duì)取向的運(yùn)動(dòng)自由度。從能量變化的角度來講，自由肽段與蛋白質(zhì)分子的結(jié)合會(huì)降低肽段的自由度，從而降低整個(gè)過程的熵變

15、不利于反應(yīng)的進(jìn)行。PDZ12串列體則顯示其兩個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域和五肽連接片段之間存在著一套聯(lián)動(dòng)機(jī)制，這使它能夠在肽段結(jié)合后通過提高結(jié)構(gòu)域間相對(duì)運(yùn)動(dòng)的自由度來彌補(bǔ)肽段結(jié)合帶來的熵?fù)p失，更利于蛋白與肽段的結(jié)合。通過結(jié)構(gòu)域之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)來調(diào)控蛋白和配體的相互作用強(qiáng)度是一種全新的蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)與功能關(guān)系的模式，我們預(yù)計(jì)這一調(diào)控方式具有在多結(jié)構(gòu)域模塊的支架蛋白中普遍存在。
　　介導(dǎo)膜融合的SNARE蛋白Ykt6的結(jié)構(gòu)更為簡(jiǎn)單，由一個(gè)球狀的long

16、in結(jié)構(gòu)域和一段60個(gè)氨基酸殘基左右的SNARE核心區(qū)兩部分組成，但它在生理過程中依然會(huì)發(fā)生復(fù)雜的構(gòu)象變化。其結(jié)構(gòu)中，SNARE核心區(qū)在囊泡運(yùn)輸過程囊泡與目標(biāo)膜層的對(duì)接和融合中起著核心作用，而longin結(jié)構(gòu)域則有著調(diào)控SNARE核心區(qū)構(gòu)象的功能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在體系中加入DPC脂質(zhì)分子會(huì)使得YKt6蛋白整體處于關(guān)閉構(gòu)象，類似生理狀態(tài)下法尼?；痀kt6蛋白的自抑制狀態(tài)。這時(shí)，SNARE核心區(qū)包裹在longin結(jié)構(gòu)域外側(cè)，在longin結(jié)構(gòu)域

17、和SNARE核心區(qū)的界面上形成疏水槽用以容納脂質(zhì)分子疏水側(cè)鏈。而當(dāng)體系中沒有脂質(zhì)分子時(shí)，Ykt6蛋白則呈現(xiàn)出比較廣泛的運(yùn)動(dòng)范圍，在多個(gè)構(gòu)象之間運(yùn)動(dòng)切換。通過對(duì)含DPC分子的體系(DPC-Ykt6)，無底物結(jié)合態(tài)體系(apo-Ykt6)和法尼?；w系(far-Ykt6)各50納秒的模擬，我們發(fā)現(xiàn)DPC分子能夠用其親水端和疏水端同時(shí)與Ykt6蛋白作用，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)并使之只在局部構(gòu)象空間中運(yùn)動(dòng)。相比之下，apo-Ykt6體系由于沒

18、有疏水鏈的存在疏水槽發(fā)生坍縮形變，整個(gè)蛋白的構(gòu)象分布也更廣，表現(xiàn)出與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似的多構(gòu)象切換特點(diǎn)。far-Ykt6體系則保持了DPC-Ykt6體系主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在構(gòu)象空間上顯示出與DPC-Ykt6體系相似的集中分布，說明體系在50納秒的分子動(dòng)力學(xué)模擬后已經(jīng)達(dá)到收斂。蛋白質(zhì)分子處在穩(wěn)定的構(gòu)象狀態(tài)并與apo-Ykt6體系存在構(gòu)象重疊。我們的結(jié)果解釋了DPC分子對(duì)Ykt6蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定機(jī)制，同時(shí)也證明了DPC-Ykt6結(jié)構(gòu)能夠很好地代表法尼

19、?；痀kt6蛋白的結(jié)構(gòu)。以往人們公認(rèn)脂質(zhì)化修飾的功能是幫助蛋白在膜上定位，而脂質(zhì)化修飾主動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白構(gòu)象變化則是一種全新的功能模式。我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)化修飾對(duì)Ykt6構(gòu)象變化的調(diào)控符合蛋白質(zhì)構(gòu)象調(diào)控中的“構(gòu)象選擇”模型，即蛋白質(zhì)自身“預(yù)先”存在多個(gè)構(gòu)象，構(gòu)象的調(diào)控是通過與其他蛋白或配體相互作用，移動(dòng)構(gòu)象分布平衡來實(shí)現(xiàn)的。
　　我們的工作表明蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象柔性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)具有重要的功能意義，長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果使蛋白質(zhì)具有高度精密的整體協(xié)調(diào)性來

20、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子的大幅度構(gòu)象變化，并且這種調(diào)節(jié)模式具有多樣性的特點(diǎn)。BtuCD和MsbA轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋自能夠協(xié)調(diào)自身各結(jié)構(gòu)單元，通過核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域的耦合機(jī)制進(jìn)行底物分子的運(yùn)輸。PDZ12串列體能夠協(xié)調(diào)肽段結(jié)合位點(diǎn)和五肽連接片段的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)性質(zhì)，通過提高PDZ結(jié)構(gòu)域之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)自由度彌補(bǔ)結(jié)合肽段造成的熵?fù)p失。Ykt6蛋白則能夠?qū)χ|(zhì)長(zhǎng)鏈進(jìn)行響應(yīng)，調(diào)控自身在構(gòu)象空間上的分布。此外，我們的工作也表明分子動(dòng)力學(xué)模擬是研究蛋白質(zhì)分子大幅度構(gòu)象