橙汁與柑橘園中脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離鑒定與檢測研究.pdf

1、脂環(huán)酸芽孢桿菌可造成巴氏滅菌的果汁腐敗，影響果汁的品質(zhì)，引起國際的關(guān)注，已成為果汁國際貿(mào)易技術(shù)壁壘的新內(nèi)容。國際貿(mào)易中嚴(yán)格要求每10 mL濃縮果汁中脂環(huán)酸算芽孢桿菌的含量小于1個。而我國在脂環(huán)酸芽孢桿菌分離、檢測方法等方面的研究較少，且僅側(cè)重于蘋果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的研究，對橙汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌研究較少。因此，對橙汁與柑橘園中脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離、鑒定與檢測技術(shù)這對我國橙汁生產(chǎn)和貿(mào)易都具有十分重要的意義。
　　 本文以柑橘園及不

2、同橙汁中分離得到的13株具有耐酸耐熱性的菌株為研究材料，首先對其進行了菌落形態(tài)、培養(yǎng)基氣味、耐酸性、耐熱性、革蘭氏染色等常規(guī)檢測；隨后對分離菌株進行了16S rDNA序列聚類分析；研究了分離菌株的16S rDNA PCR-RFLP限制性酶切特征圖譜，并進行了聚類分析；此外，還根據(jù)脂環(huán)酸芽孢桿菌的16S rDNA設(shè)計了一對特異性強，靈敏度高的引物。具體研究結(jié)果如下：
　　 (1)選用BAT培養(yǎng)基在45℃2～5 d的培養(yǎng)條件，從橙汁

3、及柑橘園中分別分離得到8株和2株脂環(huán)酸芽孢桿菌。因此，BAT培養(yǎng)基在45℃2～5 d的培養(yǎng)條件，可作為橙汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的選擇性培養(yǎng)基。
　　 (2)本研究以分離菌株NFC-1為研究材料，對其生長曲線進行了研究，結(jié)果表明該菌經(jīng)過18 h培養(yǎng)后進入對數(shù)生長期，在25 h菌體濃度能達到最高，隨后進入穩(wěn)定生長期。從而確定該菌的基因組DNA提取條件為：225 r/min45℃氣浴搖床培養(yǎng)25 h。
　　 (3)對13株分離菌與

4、3種脂環(huán)酸芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌的16S rDNA序列對比，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，橙汁中8株具有耐酸耐熱性的菌株均為脂環(huán)酸芽孢桿菌屬，其中1株Alicyclobacillus acidiphilus DSM14558，3株Alicyclobacillus acidoteresstris DSM3922，4株A.acidocaldcular柑橘園中有2株耐酸耐熱菌為Alicyclobacillus acidiphilus DSM14558

5、。
　　 (4)采用16S rDNA PCR-RFLP法對分離得到的13株耐酸耐熱性菌株與3種脂環(huán)酸芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌進行聚類分析。結(jié)果表明，在87％的相似水平上，所有菌株分為5個種群和10個分支，其中P-1、P-5、K-1與標(biāo)準(zhǔn)菌A.acidiphilus DSM14558相似水平較高，可視為同一個種，即嗜熱脂環(huán)酸芽孢桿菌；H-1、ZH-1、ZH-2與A.acidoterrestrius DSM3922相似水平較高，可視為同一個

6、種，即酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌；NFC-1、NFC-2、NFC-4、NFC-10另分一支，NFC-4號菌經(jīng)克隆測序及序列比對，結(jié)果與嗜酸耐熱菌中的A.acidocaldarus序列同源性高達99％以上，說明這4株菌均是酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌。此外，16S rDNA PCR-RFLP聚類與16S rDNA序列分析聚類結(jié)果較為一致，由此說明本研究結(jié)果是可靠的。
　　 (5)根據(jù)16S rDNA屬間的高變區(qū)，種間的保守區(qū)，設(shè)計出一對針對脂環(huán)酸芽

7、孢桿菌的特異性強、靈敏度高的引物。通過優(yōu)化試驗，得到最佳擴增條件為：25μL擴增體系中，ddH2O17.75μL，10×buffer2.5μL，25 mM Mg2+1.5μL，10 mM dNTP1.5μL，35L0.3μL，35R0.3μL，5U/ul Taq酶0.13μL，DNA模板1μL。擴增條件為：94℃5 min；94℃40 s，59.8℃40 s，72℃40 s，35個循環(huán)；72℃8 min。在最佳的擴增程序下，PCR擴增脂

8、環(huán)酸芽孢桿菌的基因組DNA最低量為10-4 pg，擴增脂環(huán)酸芽孢桿菌的最低菌液濃度為3.0×103 CFU/mL。
　　 (6)成功建立了脂環(huán)酸芽孢桿菌的PCR快速檢測方法。該方法的整體體系為：20 mL橙汁→80℃13 min→10 mL接種于BAT培養(yǎng)液→225 r/min45℃的條件下氣浴振蕩培養(yǎng)25 h→采用CTAB法提取DNA→進行PCR擴增→瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物→結(jié)果判斷。整個檢測過程約需要2～5 d，而傳統(tǒng)常規(guī)檢