阿維鏈霉菌一氧化氮合酶的基因克隆及生物功能初步研究.pdf

1、一氧化氮合酶(NOS)是一種基于亞鐵血紅素的單個(gè)氧化酶,具有將L-精氨酸氧化成NO和瓜氨酸的功能。它合成的NO作為一種化學(xué)信號(hào)分子和細(xì)胞毒劑,在高級(jí)生物體中具有極其廣泛的生物調(diào)控作用。雖然人類在許多細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了類似于真核生物一氧化氮合酶(euNOS)的基因序列,但迄今為止我們只研究了少數(shù)細(xì)菌的一氧化氮合酶(bNOS)的功能。據(jù)研究顯示,哺乳動(dòng)物的一氧化氮合酶具有一個(gè)氧化域和一個(gè)專門提供電子的還原域。但細(xì)菌中的一氧化氮合酶卻缺乏還原域和

2、類似專門的電子供體。因此,有些人推斷bNOS的功能可能不同于euNOS的功能,包括消化不同的代謝物質(zhì)和抗氧化保護(hù)能力方面。關(guān)于bNOS的研究可能會(huì)令人類對(duì)NOS的機(jī)理有全新的認(rèn)識(shí),并發(fā)現(xiàn)NOS的新功能。由于阿維鏈霉菌基因組中也存在著bNOS的一段高同源性的未知基因序列。本文決定對(duì)阿維鏈霉菌的類似nos基因序列進(jìn)一步確認(rèn),并對(duì)其在鏈霉菌屬的生物功能進(jìn)行初步研究,以進(jìn)一步豐富關(guān)于微生物bNOS的功能研究材料,為微生物的科學(xué)利用提供新的思路。

3、
　　 本文從基因組提取阿維鏈霉菌基因組DNA,通過(guò)PCR手段成功釣取到阿維鏈霉菌一氧化氮合酶類似基因(sanos)DNA。經(jīng)生物信息學(xué)的分析,發(fā)現(xiàn)該序列與NCBI上公布的NOS Streptomyces avermitilisMA-4680 DNA(編號(hào)為NC-003155)的同源性高達(dá)99％,與Streptomyces scabiei(編號(hào)為NC-013929)的同源性高達(dá)84％,與Homosapiens(編號(hào)為NP_001

4、123373.1)的同源性達(dá)69％,可初步確定為一氧化氮合酶序列。此外,該序列由516aa組成,分子量約為56.4kDa,理論等電點(diǎn)pI=6.71,為不穩(wěn)定的親水性蛋白。而且相較大多數(shù)細(xì)菌一氧化氮合酶,它的N-端具有N-端鉤和鋅環(huán)指區(qū)域,與哺乳動(dòng)物的一氧化氮合酶結(jié)構(gòu)更加接近。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證sanos是真正的一氧化氮合酶序列,我們?cè)O(shè)計(jì)了阿維鏈霉菌一氧化氮合酶(saNOS)體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),通過(guò)構(gòu)建pET28a-saNOS表達(dá)載體

5、,并利用IPTG誘導(dǎo)saNOS在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)體系進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)IPTG濃度為0.2mM,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為8h時(shí),saNOS蛋白表達(dá)量最大。經(jīng)一氧化氮合酶試劑盒測(cè)定saNOS活性,確定sanos是一氧化氮合酶序列,且能轉(zhuǎn)錄翻譯成具有活性的一氧化氮合酶。
　　 在此基礎(chǔ)上,本文通過(guò)接合轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)獲得擁有saNOS基因的天藍(lán)色鏈霉菌突變株M-1,并利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了saNOS在天藍(lán)色鏈霉菌

6、中的表達(dá)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變株M-1相較原始菌株,氣生菌絲和包子發(fā)育都有所延緩,但抗生素Act和Red的生產(chǎn)時(shí)間則不變。其中,Act合成量提高,Red合成量降低。此外,通過(guò)研究添加NO供體SNP、NO淬滅劑cPTIO和NO抑制劑L-NMMA對(duì)阿維鏈霉菌的影響,發(fā)現(xiàn)高濃度NO能延緩阿維鏈霉菌的形態(tài)分化,且能提高黑色素的分泌量。因此,我們可推斷:在形態(tài)分化方面,saNOS產(chǎn)生的高濃度NO雖然不會(huì)阻斷鏈霉菌的形態(tài)分化過(guò)程,但具有延緩作用。在次