1,25(OH)2D3對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎破骨細(xì)胞形成影響可能機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　骨破壞是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA)的一大重要特點(diǎn)，且骨破壞程度與疾病嚴(yán)重程度及疾病導(dǎo)致的功能喪失密切相關(guān)。導(dǎo)致RA骨破壞的主要原因是滑膜炎，同時(shí)還有炎性因子和RANKL的分泌增加以及抗瓜氨酸組蛋白抗體的產(chǎn)生增加。既往研究發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞因子、自身抗體和RANKL均可刺激具有骨吸收功能的破骨細(xì)胞的分化，同時(shí)，體內(nèi)有多條信號(hào)通路（如 JAK-2/STAT-3和p38 MAPK/NF-κB通

2、路等）通過(guò)不同的作用機(jī)制影響破骨細(xì)胞的增殖分化。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，維生素D缺乏普遍存在于RA患者，且增加維生素D攝入，可以延緩和控制 RA的發(fā)生發(fā)展。而維生素 D的經(jīng)典作用是維持體內(nèi)鈣、磷平衡的調(diào)節(jié)，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)其還在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中發(fā)揮重要作用，故把它劃分為一種新型的免疫抑制劑。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，（1）IL-22在RA疾病過(guò)程中有促進(jìn)炎癥和促進(jìn)破骨細(xì)胞形成的作用；（2）1,25(OH)2D3可降低RA患者血清中IL-22水平

3、，且呈劑量依賴性抑制RANKL表達(dá)；（3）1,25(OH)2D3能夠經(jīng)過(guò)阻斷 IL-22下游的 JAK-2/STAT-3和p38 MAPK/NF-κB通路來(lái)抑制RANKL的分泌。本研究將進(jìn)一步通過(guò)比較各給藥組破骨細(xì)胞分化的情況，來(lái)直觀的觀察1,25(OH)2D3能否通過(guò)阻斷這一信號(hào)通路，來(lái)抑制破骨細(xì)胞的生成。
　　目的：
　　1.研究1,25(OH)2D3是否能夠抑制破骨細(xì)胞的增殖分化；
　　2.研究1,25(OH)2

4、D3是否能通過(guò)阻斷 IL-22下游的 JAK-2/STAT-3和p38MAPK/NF-κB通路來(lái)抑制RA破骨細(xì)胞的生成。
　　方法：
　　1.從健康志愿者外周血中分離 PBMCs，用 RANKL（30ng/mL）、M-CSF（25ng/mL）誘導(dǎo)PBMC分化成破骨細(xì)胞，用1,25(OH)2D3（1nM）干預(yù)：分為以下3組：A組 PBMC+M-CSF；B組 PBMC+M-CSF+RANKL；C組PBMC+M-CSF+RANKL

5、+1,25(OH)2D3。于培養(yǎng)的第14d終止培養(yǎng)，固定玻片上細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色，鏡下觀察破骨細(xì)胞形成情況；用RT-PCR檢測(cè)所加藥物對(duì)破骨細(xì)胞表面的標(biāo)志物TRAP、組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9 mRNA的表達(dá)的影響。
　　2.從RA患者的滑膜組織中分離培養(yǎng)FLS至4~8代；從健康志愿者外周血分離出PBMCs,均加入M-CSF（25ng/mL）預(yù)處理；3d后，將兩者共培養(yǎng)，同時(shí)按分組加入RANKL（30ng

6、/mL）、M-CSF（25ng/mL）、IL-22（10ng/mL）、1,25(OH)2D3（1nM）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白抑制劑等藥物，分為以下五組：a組：PBMC+RA-FLS+M-CSF；b組：PBMC+RA-FLS+M-CSF+RANKL；c組：PBMC+RA-FLS+M-CSF+IL-22+1,25(OH)2D3；d組：PBMC+ RA-FLS+M-CSF+1,25(OH)2D3+IL-22+AG490（JAK-2抑制劑）；f組：PB

7、MC+RA-FLS+M-CSF+1,25(OH)2D3+IL-22+SB203580（p38-MAPK抑制劑）。于共培養(yǎng)的第14d終止培養(yǎng)，固定玻片上細(xì)胞并行TRAP染色，觀察破骨細(xì)胞生成的情況；用RT-PCR檢測(cè)所加藥物對(duì)破骨細(xì)胞表面的標(biāo)志物TRAP、組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9 mRNA的表達(dá)的影響。
　　3.數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)一中A、B、C三組破骨細(xì)胞（TR

8、AP染色陽(yáng)性的多核細(xì)胞）數(shù)量分別為7±0.816（個(gè)）、30±2.944（個(gè)）、5±2.16（個(gè)），B組較A組細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；C組較B組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.B組破骨細(xì)胞標(biāo)志物TRAP、組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9 mRNA的表達(dá)較A、C兩組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.實(shí)驗(yàn)二中a組、b組、c組、d組、f組的破骨細(xì)胞數(shù)

9、量依次是7.5±1.732（個(gè)）、38.5±3.416（個(gè)）、0.5±0.477（個(gè)）、21.75±3.775（個(gè)）、9±2.944（個(gè)）；b組較a組細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；c,d,f三個(gè)組細(xì)胞數(shù)量較b組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；d組和f組的細(xì)胞數(shù)量較c組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4.a組、c組、d組及f組中TRAP、組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9