ε-聚賴氨酸抑制致病菌分子機理及對腸道菌群多樣性影響的研究.pdf

1、ε-聚賴氨酸(ε-PL)是天然存在的一類聚氨基酸，具有對細菌、酵母菌、霉菌的廣譜抗性，且安全無毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性高。作為逐漸被推廣使用的食品防腐劑，其抗菌的分子機制尚未清晰闡明。
　　本論文通過微生物培養(yǎng)，原子力顯微鏡(AFM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察，抑制消減雜交文庫篩選，實時定量PCR和基因敲除等技術，并根據(jù)不同技術選取適合的研究對象，對ε-PL抑制典型致病菌（食源性、醫(yī)源性）的現(xiàn)象和分子機制進行了深入的研究。最后采

2、用PCR-DGGE技術，評估了口服ε-PL對小鼠腸道微生態(tài)菌群的影響。
　　論文分為六個章節(jié)。第一章對食品防腐劑，尤其是天然防腐劑的分布、性質、特性進行了描述，重點對天然微生物抗菌劑ε-PL的理化性質、抗菌活性及機制，應用范圍和發(fā)展方向進行了系統(tǒng)的闡述。
　　在第二章中，以EscherichiacoliO157∶H7為模式微生物，系統(tǒng)探討了ε-PL對致病菌的抑菌活性和分子機制。結果發(fā)現(xiàn)ε-PL拮抗E.coliO157∶H7的

3、活性隨溫度的升高(4℃、25℃和37℃)和處理時間的延長(0～15h)遞增;在pH5～7環(huán)境中抑菌活性沒有顯著變化，在pH大于8時活性降低。AFM和TEM觀察結果表明，ε-PL能破壞細胞膜的結構，形成膜穿孔，使胞質呈不均勻分布，細胞內容物泄漏。ε-PL能誘導細菌內活性氧的產生，且其濃度隨著ε-PL濃度的增加而升高。RT-qPCR檢測結果表明，ε-PL能對細菌產生氧脅迫，損傷細菌DNA，并抑制E.coliO157∶H7的侵染毒力。

4、　　為進一步研究ε-PL的抑菌分子機理，探討其對致病菌的基因調控影響，在第三章中以常見感染且難以抑殺的條件致病菌-白色念珠菌(CandidaalbicansATCC14053)為研究對象，采用SSH技術對ε-PL抑菌前后的差異基因進行了篩選。RT-qPCR驗證結果顯示，在ε-PL亞致死濃度脅迫下，C.albicans有10個發(fā)生差異表達的基因，表明ε-PL能通過降低糖酵解和脂類代謝相關基因的表達，抑制C.albicans的糖代謝并導致C

5、.albicans中脂類代謝的紊亂。蛋白質合成相關基因GCN1、精氨酸t(yī)RNA合成酶及泛素蛋白連接酶Asi3的上調表達則表明，ε-PL的抑菌活性能破壞細胞結構，并促進C.albicans蛋白的降解。
　　通過基因敲除造成基因缺失是進一步驗證ε-PL抑菌分子機制的有效方法。腸炎沙門氏菌是污染食品的主要食源性致病菌，其雙組分信號轉導系統(tǒng)以特定的方式調控沙門氏菌的毒力，抵抗抗菌肽的抑菌作用?；谏抽T氏菌的基因敲除系統(tǒng)有方法成熟，且操作簡

6、單的優(yōu)勢，在第四章中，通過敲除S.enteritidis中抵抗抗菌肽的調控系統(tǒng)PhoP-PhoQ和RcsFCDB中的關鍵基因PhoP和rcsF,比較了ε-PL對S.enteritidis野生株和基因敲除株的相關基因表達影響的差異，探討其抑制S.enteritidis的分子機制。結果顯示S.enteritidisΔphoP對ε-PL的敏感性顯著增加，且PhoP-PhoQ所調控的下游基因的表達顯著下降，而S.enteritidisΔrcsF

7、在ε-PL中的生長速率較之野生株沒有顯著差異，表明PhoP-PhoQ調控系統(tǒng)在S.enteritidis抵抗ε-PL的過程中起到關鍵性的作用，而RcsFCDB調控系統(tǒng)則不能被ε-PL激活。
　　ε-PL作為食品防腐劑，是否會對機體腸道微生態(tài)菌群平衡造成影響，未見報道。在第五章中，采用PCR-DGGE和RT-qPCR相結合的方法，分析了灌胃ε-PL兩周過程中小鼠糞便中菌群結構和數(shù)量的變化。結果顯示，乳桿菌屬菌群多樣性有所增加。乳桿菌