蛭弧菌的分離、鑒定及對(duì)腸道致病菌噬菌特性的研究.pdf

1、近年來，盡管食品安全問題集中在諸如農(nóng)獸藥殘留超標(biāo)、非法添加化學(xué)原料、添加劑的濫用以及隨著生活水平提高帶來的營(yíng)養(yǎng)過剩等方面，但食源性疾病仍然是全球食品安全的主要問題。食源性疾病暴發(fā)又稱食物中毒，其中66％以上的食物中毒為細(xì)菌性致病所致。國(guó)內(nèi)外由于食物鏈中病原細(xì)菌污染及其造成的食源性疾病屢見不鮮?？股氐某霈F(xiàn)對(duì)人類健康和生命保護(hù)起到了關(guān)鍵作用，但是大量不合理的使用抗生素使得細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重，而細(xì)菌耐藥性也助推了食源性細(xì)菌疾病的流行。

2、>　　 與食品有直接和間接關(guān)系的致病性微生物都可能污染食品，但有檢驗(yàn)意義的是能引起人類疾病和食物中毒的致病性微生物，常見的有：沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌、變形桿菌、志賀氏菌、禽流感病毒、黃曲霉菌及病毒、口蹄疫病毒等。我國(guó)對(duì)食品中的一些致病微生物的指標(biāo)定義不得檢出，而對(duì)另一些則有限量指標(biāo)。因此，必須加強(qiáng)對(duì)這些主要的致病微生物的研究和防控工作。天然、無(wú)殘留的滅菌方法是食品生產(chǎn)、加工、消費(fèi)等各個(gè)環(huán)節(jié)的迫切需求。
　　

3、本文分別從浙江寧海海水、海泥中分離鑒定蛭弧菌，比較不同蛭弧菌株對(duì)腸道致病菌的裂解能力差異。并對(duì)所分離的菌株進(jìn)行電鏡形態(tài)觀測(cè)，進(jìn)行16S rDNA鑒定分析，通過比較分析噬菌斑大小以及蛭弧菌與宿主菌共培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線變化，研究其噬菌特性，以期為蛭弧菌對(duì)食源性細(xì)菌進(jìn)行防控的應(yīng)用提供相關(guān)基礎(chǔ)研究。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 一、海水和海泥蛭弧菌的分離及純化
　　 蛭弧菌是一種細(xì)菌寄生菌，必須以宿主菌作為唯一的營(yíng)養(yǎng)來源。目前

4、分離蛭弧菌大多采用以菌養(yǎng)菌的方式，通過雙層平板法得到蛭弧菌與宿主菌形成的噬菌斑。根據(jù)宿主菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式對(duì)不同OD值加以換算，得到對(duì)應(yīng)的菌落數(shù)(CFU/mL)。本實(shí)驗(yàn)中所用的宿主菌均為培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期的菌液，根據(jù)生長(zhǎng)曲線找到宿主菌各自進(jìn)入對(duì)數(shù)后期所需的培養(yǎng)時(shí)間，其中，鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌2a、大腸埃希氏菌和奇異變形桿菌在24h時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)后期；副溶血性弧菌在36h達(dá)到對(duì)數(shù)后期；甲型副傷寒沙門氏菌、侵襲性大腸桿菌和河弧菌在48h達(dá)到對(duì)

5、數(shù)后期。以噬菌斑出斑時(shí)間最短、數(shù)量最多、直徑不再增加的平板對(duì)應(yīng)的宿主菌含量為最佳分離條件，其中除了副溶血性弧菌的最佳添加量為0.8mL外，其余可以被裂解的宿主菌的最佳添加量均為1.0mL。
　　 實(shí)驗(yàn)分別從海水和海泥中共得到6株蛭弧菌株。分別為從海水中分離的能裂解福氏志賀氏菌的Bs2、裂解侵襲性大腸埃希氏菌的Bs5、裂解副溶血性弧菌的Bs7;從海泥中分離的能裂解鼠傷寒沙門氏菌的Bm1，裂解奇異變形桿菌的Bm6，裂解副溶血性弧菌的

6、Bm7。其中Bs2和Bm1噬菌斑的直徑在1～2mm之間，Bs5和Bm6噬菌斑的直徑在2～4mm之間，Bs7和Bm7噬菌斑的直徑在5～7mm之間。
　　 二、海水和海泥蛭弧菌的鑒定及保存
　　 上游引物63F和下游引物Bdg842R無(wú)法在400bp產(chǎn)生目的條帶，只有大量的引物二聚體形成。上游引物63F和下游引物P3無(wú)法在800bp產(chǎn)生目的條帶，有引物二聚體和雜帶產(chǎn)生。上游引物Bac676F和下游引物Bac1442R可以在8

7、00bp產(chǎn)生產(chǎn)生單一亮帶，證實(shí)不儀證實(shí)本研究分離純化的噬斑分離物均為蛭弧菌，而且表明分離到的6株菌株都屬于噬菌蛭弧菌屬(Bacteriovorax spp.)。對(duì)所分離到的6株菌進(jìn)行負(fù)染，并在透射電鏡下觀察其大小和形態(tài)，蛭弧菌菌體短小，呈弧狀、桿狀，有一端生波浪狀的鞭毛。
　　 利用滅菌海水作為保護(hù)液時(shí)，4℃冰箱中保存的所有菌株在91天時(shí)仍可以出斑，表明蛭弧菌此時(shí)仍有噬菌活性，蛭弧菌在4℃滅菌海水中至少可存活91天；而室溫?fù)u床中

8、保存的蛭弧菌株的復(fù)蘇情況有所差異，Bs2至少可存活49天，Bs5、Bs7、Bm1、Bm7至少可存活63天，Bm6至少可存活56天。利用生理鹽水作為保護(hù)液時(shí)，4℃冰箱保存的所有菌株在91天時(shí)仍可以出斑，表明蛭弧菌在4℃生理鹽水中至少可存活91天；在室溫?fù)u床中，Bs7和Bm7至少可以存活49天，而Bs2、Bs5、Bm1、Bm6的復(fù)蘇能力相對(duì)較弱，至少可存活28天。利用加宿主菌的滅菌海水作為保護(hù)液時(shí)，4℃冰箱保存的所有蛭弧菌株，在7天時(shí)都不能

9、形成噬菌斑，表明蛭弧菌在4℃加宿主菌的滅菌海水中7天即可失去活性；而在室溫?fù)u床環(huán)境下，除了Bs7和Bm7至少可存活21天外，其余菌株只能存活7天。利用加宿主菌的生理鹽水作為保護(hù)液時(shí)，4℃冰箱保存的Bs2、Bs5、Bm1、Bm6至少可存活14天，而Bs7和Bm7在7天時(shí)即無(wú)噬菌斑檢出；在室溫?fù)u床環(huán)境下，大部分菌株至少可以存活28天，其中Bs7和Bm7至少可存活14天。
　　 三、蛭弧菌對(duì)腸道致病菌的噬菌特性
　　 Bs2、

10、Bs5、Bm1和Bm7分別在72h時(shí)達(dá)到各自裂解率的峰值，裂解率分別為43.56％、71.28％、67.66％、95.81％;Bs7和Bm6分別在48h、96h時(shí)達(dá)到各自裂解率的峰值，裂解率分別為98.70％和74.69％。另外，Bs2、Bs5、Bm1和Bm7的噬菌斑數(shù)量(PFU/mL)對(duì)應(yīng)的在72h時(shí)達(dá)到各自的峰值，分別為770、507、1064、240;Bs7和Bm6分別在48h、96h時(shí)達(dá)到峰值，噬菌斑數(shù)量(PFU/mL)分別為2

11、79和588。
　　 海洋蛭弧菌對(duì)不同宿主菌的裂解能力有差異，其中，Bs7和Bm7對(duì)同樣來自海洋環(huán)境的副溶血性弧菌的裂解能力最強(qiáng)，裂解率都在95％以上，其次為Bm6對(duì)奇異變形桿菌的裂解率74.69％，而對(duì)陸生環(huán)境的其他宿主菌的裂解能力就相對(duì)較弱。不同來源的蛭弧菌株對(duì)同種宿主菌的裂解能力也不同，海水中的蛭弧菌可以裂解福氏志賀氏菌和侵襲性大腸埃希氏菌，而海泥中的蛭弧菌對(duì)這兩種宿主菌無(wú)感染力，但是可以裂解鼠傷寒沙門氏菌和奇異變形桿菌。

12、蛭弧菌在裂解宿主菌的過程中，并不能將宿主菌完全消滅，只能將其數(shù)量控制在一定的范圍內(nèi)，而且有時(shí)間的限制。隨著蛭弧菌裂解能力的強(qiáng)弱變化，蛭弧菌噬菌斑的數(shù)量也有著對(duì)應(yīng)的增減變化。
　　 四、蛭弧菌對(duì)食源性細(xì)菌的防控
　　 用蛭弧菌噴灑的豬、魚肉樣品組的菌落總數(shù)、大腸菌群和pH值的上升趨勢(shì)都比沒有噴灑蛭弧菌的空白組要緩慢。其中蛭弧菌對(duì)豬肉在72h內(nèi)菌落總數(shù)的平均裂解率為51.55％，對(duì)魚肉在72h內(nèi)菌落總數(shù)平均裂解率為62.08