面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)對中國鹵蟲(Artemia sinica)抗弧菌感染的影響與酚氧化酶原在鹵蟲早期發(fā)育過程中表達時相的研究.pdf

1、鹵蟲又名鹽水豐年蟲,隸屬于節(jié)肢動物門,甲殼綱,具有廣溫、耐高鹽等特性,因其營養(yǎng)價值極高,且其休眠卵便于保存,運輸?shù)葍?yōu)點成為海水養(yǎng)殖業(yè)中非常重要的餌料生物。近年來,在甲殼動物疾病感染機制、生物體抗性反應(yīng)機制和餌料營養(yǎng)價值分析等方面被作為一種極好的模式生物進行了的相關(guān)研究。與其他無脊椎動物類似,鹵蟲缺乏特異性免疫系統(tǒng),沒有免疫記憶能力,只能依靠非特異性免疫反應(yīng)來抵御病原菌侵染,其中,由酚氧化酶原激活系統(tǒng)、溶酶體酶(含溶菌酶)和抗氧化酶類(含

2、超氧化物歧化酶)等構(gòu)成的體液免疫反應(yīng),在其免疫防御中發(fā)揮著十分重要的作用,其中,酚氧化酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶己被用作評價甲殼動物免疫力的指標之一。
　　 近年來,甲殼動物如蝦、蟹等的養(yǎng)殖病害的發(fā)生日趨嚴重,其中,細菌類疾病中由弧菌引起的養(yǎng)殖動物的致死率最高,使養(yǎng)殖業(yè)遭受了巨大的經(jīng)濟損失,已成為阻礙水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的限制性因素。使用化學(xué)藥物進行防治的方法,因易造成環(huán)境污染、藥物殘留、危害人體健康等問題,其應(yīng)用已受到了嚴格的限

3、制。開拓新的有效的病害防治方法,變得尤為迫切。通過研究甲殼動物的免疫機制,提高甲殼動物免疫力,從而增強其抗病力的途徑被認為是解決養(yǎng)殖甲殼動物疾病爆發(fā)的關(guān)鍵。
　　 本文比較研究了野生型(WT)面包酵母菌(SC)和其細胞壁同源突變型(mnn9)兩種SC酵母菌株作為鹵蟲餌料,對鹵蟲抗弧菌VC感染的免疫機制的影響作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),分別投喂鹵蟲WT和mnn9,于培養(yǎng)兩天后,兩組鹵蟲的存活率出現(xiàn)顯著性差異,同時,對其進行VC侵染實驗發(fā)現(xiàn),于

4、侵染24h時,兩組之間也出現(xiàn)顯著性差異,而且均是投喂mnn9的鹵蟲明顯高于投喂WT的鹵蟲,隨著培養(yǎng)時間的延長,這種差異越來越大。對培養(yǎng)至第三天時投喂WT或mnn9的鹵蟲體長分別進行了測定發(fā)現(xiàn),投喂mnn9的鹵蟲體長明顯大于投喂WT的鹵蟲。另外,又對投喂WT和mnn9的鹵蟲的PO、SOD和LSZ活性變化進行了檢測,發(fā)現(xiàn)于侵染后不同時間,投喂mnn9的鹵蟲的三種免疫酶活性均明顯高于投喂WT的鹵蟲。在無弧菌侵染的情況下,得到了與此相一致的結(jié)論

5、。分析認為,mnn9相對于WT,對鹵蟲具有更高的營養(yǎng)價值,并且其細胞壁突變使其成分發(fā)生變化,β-葡聚糖及幾丁質(zhì)含量均高于WT酵母菌,因此推測,mnn9首先可以通過營養(yǎng)強化增強鹵蟲體質(zhì),又可以通過細胞壁免疫刺激成份如β-葡聚糖和幾丁質(zhì)形成對鹵蟲非特異性免疫系統(tǒng)持續(xù)有益的刺激,從而提高鹵蟲的免疫酶活性表達水平,增強其抗VC感染的免疫力,進而提高了存活率。
　　 弧菌VC對鹵蟲進行侵染后發(fā)現(xiàn),于侵染后24h時,投喂WT的鹵蟲的存活率明

6、顯降低,并隨著侵染時間的延長,急劇下降。對其PO、SOD和LSZ活性的檢測同樣發(fā)現(xiàn),三種免疫酶活性也均于侵染后不同時間出現(xiàn)了顯著性下降。說明弧菌VC侵染導(dǎo)致了鹵蟲先天性免疫系統(tǒng)受損,從而降低了相關(guān)的免疫酶活性,引起鹵蟲存活率降低。
　　 WT或mnn9經(jīng)熱激誘導(dǎo)后,蛋白免疫印跡實驗顯示其熱激蛋白Hsp70的表達量增多,投喂鹵蟲熱激WT后發(fā)現(xiàn),于侵染后48h-72h時,其存活率比投喂正常培養(yǎng)WT的鹵蟲的明顯更高。對其PO、SOD和

7、LSZ三種免疫相關(guān)酶活性的檢測同樣發(fā)現(xiàn),投喂熱激WT的鹵蟲具有更高的酶活性。因此分析認為,酵母菌熱激后熱激蛋白的增多可能是導(dǎo)致鹵蟲免疫系統(tǒng)增強的主要因素,通過某種仍然未知的機制,刺激了鹵蟲的非特異性免疫系統(tǒng),使其免疫酶活性水平增高,最終提高了鹵蟲抗感染的能力,使存活率升高。
　　 本文利用已知美國鹵蟲的酚氧化酶原cDNA序列全長設(shè)計引物,利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)方法,克隆并拼接獲得了中國鹵蟲proPO的基因序列

8、全長共2125bp,編碼699個氨基酸殘基,分子量為80.37kDa,等電點為6.48。與美國鹵蟲的相似性達到99％。對其序列的保守功能結(jié)構(gòu)域進行分析,發(fā)現(xiàn)proPO含有一個蛋白酶切位點推測位于Arg75-Gly76,2個銅離子結(jié)合位點和一個1個硫羥酸酯結(jié)構(gòu)域。2個銅離子結(jié)合位點(CuA和CuB)內(nèi)含有六個高度保守的組氨酸殘基(位于氨基酸225,229,251和379,383,419處)。1個硫羥酸酯結(jié)構(gòu)域(GCGWPEHM)位于氨基酸

9、592-599處,也高度保守。通過分析得知中國鹵蟲proPO無信號肽序列。對其二級及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)其銅離子保守結(jié)構(gòu)區(qū)為α-螺旋結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn),鹵蟲遠離其他十足目甲殼動物,與水蚤形成甲殼動物的另一進化分支。
　　 以鹵蟲β-actin基因為內(nèi)參,以獲得的proPO基因序列設(shè)計特異性引物,利用半定量RT-PCR方法對中國鹵蟲5個不同發(fā)育時期(0h,6h,E(E),Instar Ⅰ和InstarⅡ期)proPO基因的轉(zhuǎn)錄表

10、達水平進行了檢測,發(fā)現(xiàn)鹵蟲的proPO基因從E期開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄表達,從E期到InstarⅡ期的表達水平?jīng)]有明顯差異。同時對這5個不同發(fā)育時期鹵蟲的PO活性進行了檢測,發(fā)現(xiàn)只有InstarⅡ期幼蟲才有明顯的PO活性。說明鹵蟲proPO轉(zhuǎn)錄本與PO酶活性的表達變化在胚胎發(fā)育過程中受到了調(diào)控。
　　 本文比較研究了弧菌侵染、餌料營養(yǎng)與免疫成分刺激及熱激蛋白對鹵蟲免疫機制的影響作用,對進一步了解目前仍不詳細的甲殼動物的免疫機制奠定了一定的