β-葡萄糖苷酶的制備以及對人參皂苷的酶法轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的:本實驗通過 Aspergillus固態(tài)發(fā)酵,分離純化制備β-葡萄糖苷酶,并利用β-葡萄糖苷酶催化人參皂苷和N-乙酰葡萄糖胺,形成新的氨基糖皂苷,從而期望獲得高效低毒的新型人參皂苷,為皂苷生物轉(zhuǎn)化研究提供新的方向和思路。
　　方法:首先,將 Aspergillus發(fā)酵所得的粗酶分別經(jīng)過 Sephadex-G150和DEAE-Sephadex-A50分離純化,獲得較純的β-葡萄糖苷酶。其次,將新鮮人參切片,洗凈,在50℃烘干,粉

2、碎。分別用70％的乙醇回流提取,乙酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇萃取部分經(jīng) D101大孔樹脂的純化,真空冷凍干燥后得到人參總皂苷。第三,將人參皂苷、N-乙酰葡萄糖胺和β-葡萄糖苷酶按照以下三種添加方式進行反應:第一組,將人參皂苷、N-乙酰葡萄糖胺和β-葡萄糖苷酶同時放入;第二組,先加入人參皂苷和β-葡萄糖苷酶,后加入 N-乙酰葡萄糖胺繼續(xù)反應;第三組,先加入 N-乙酰葡萄糖胺和β-葡萄糖苷酶,后加入人參皂苷。再次,將轉(zhuǎn)化總產(chǎn)物經(jīng)過 ODS-

3、C18反相硅膠分離純化,得到的各部分轉(zhuǎn)化產(chǎn)物同人參總皂苷和總轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行體外抗腫瘤活性評價。
　　結(jié)果:從 Aspergillus發(fā)酵得到的β-葡萄糖苷酶經(jīng) Sephadex-G150和DEAE-Sephadex-A50分離純化后,最終通過 SDS-PAGE測定去分子量為97.5KD左右,較原粗酶純化了26.84倍,說明β-葡萄糖苷酶已經(jīng)得到較好的分離。三種轉(zhuǎn)化方式通過 ESI-MS分析,第二種轉(zhuǎn)化方法最好。在33min對應的質(zhì)譜

4、為[M+Na]+979.9,[M+K]+995.6,推測其分子量為957.6,發(fā)生氨基糖的酶催化反應。通過第二種轉(zhuǎn)化方式進行放大實驗,獲得的總轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng) ODS-C18反相硅膠分離后得到35％(甲醇)、35％(乙腈)、45％(乙腈)和55％(乙腈)四部分轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。將這四種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和人參總皂苷和總轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行 HepG2肝癌細胞和caski宮頸癌細胞體外抗腫瘤活性實驗比較,其中55％轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的抗腫瘤活性為顯著。當其濃度為100μg/ml時

5、對 HepG2肝癌細胞和caski宮頸癌細胞的抑制率分別為41％和46.89％。結(jié)論:β-葡萄糖苷酶能在一定的條件下催化人參皂苷和N-乙酰葡萄糖胺發(fā)生轉(zhuǎn)化反應。但只有第二種工藝發(fā)生了N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖的轉(zhuǎn)移反應,所得到的新的N-乙酰氨基糖代皂苷化合物轉(zhuǎn)化率較高,第一種工藝和第三種工藝主要發(fā)生的β-葡萄糖苷酶的酶水解反應。第二種轉(zhuǎn)化方式的得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的體外抗腫瘤活性與總皂苷和轉(zhuǎn)化總產(chǎn)物有所提高,尤其是55％轉(zhuǎn)化產(chǎn)物隨著濃度的升高