4-1BB信號(hào)通路和薯蕷皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性矽肺發(fā)生發(fā)展的免疫調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:全球范圍內(nèi)，估計(jì)有數(shù)以百萬計(jì)的工人暴露于矽塵環(huán)境。這其中許多人接觸到的矽塵濃度都高于職業(yè)暴露限值。矽塵進(jìn)入肺組織導(dǎo)致矽肺病，矽肺是塵肺的一種，它是一種漸進(jìn)性職業(yè)性肺疾病。其特點(diǎn)是慢性肺部炎癥和不可逆的肺組織彌漫性纖維化?？蓪?dǎo)致患者失去勞動(dòng)能力甚至死亡，給社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。矽肺發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床缺乏特效治療方法。因此尋找矽塵導(dǎo)致肺纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵分子，將其作為特異性分子靶點(diǎn)并探明其作用和機(jī)制將為肺纖維化疾病的治療和診斷提供

2、新線索。我們使用蛋白芯片技術(shù)觀察矽肺模型小鼠不同時(shí)期肺組織中蛋白表達(dá)譜的變化，選擇差異表達(dá)最明顯的4-1BB蛋白進(jìn)行深入研究。探討其在矽塵導(dǎo)致肺組織纖維化中的可能作用機(jī)制，將為肺纖維化治療提供潛在靶標(biāo)。
　　研究方法:本研究以實(shí)驗(yàn)性矽肺模型小鼠為研究對(duì)象。通過氣管非暴露式灌注二氧化硅懸液，構(gòu)建矽塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化動(dòng)物模型。利用蛋白芯片篩查實(shí)驗(yàn)，對(duì)矽塵暴露早期（7天）和晚期（56天）小鼠肺組織蛋白進(jìn)行篩查實(shí)驗(yàn);得到肺組織差異變化蛋白

3、表達(dá)譜;得出矽塵暴露小鼠肺組織中4-1BB蛋白差異表達(dá)明顯。使用ELISA、Western blot、qRT-PCR、免疫組織化學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步驗(yàn)證4-1BB蛋白表達(dá)情況;通過生物信息學(xué)分析和通路分析得到與4-1BB蛋白相關(guān)的信號(hào)通路;選取通路中關(guān)鍵蛋白為靶點(diǎn)，阻斷4-1BB信號(hào)通路。使用H&E染色觀察阻斷信號(hào)通路對(duì)矽塵導(dǎo)致肺部炎癥的影響;使用Masson染色和羥脯胺酸測(cè)定，觀察阻斷信號(hào)通路對(duì)矽塵導(dǎo)致肺組織纖維化的影響;通過Weste

4、rn blot方法檢測(cè)信號(hào)通路阻斷情況;采用ELISA和CBA技術(shù)檢測(cè)各組小鼠肺泡灌洗液中相關(guān)炎性因子和小鼠肺組織蛋白中相關(guān)趨化因子的表達(dá)情況;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠肺門淋巴結(jié)中T細(xì)胞分型情況及小鼠肺組織中循環(huán)纖維細(xì)胞聚集情況。應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)小鼠肺組織中Th細(xì)胞免疫相關(guān)mRNA表達(dá)情況。
　　給予矽塵暴露小鼠不同劑量的薯蕷皂苷，應(yīng)用Masson染色觀察薯蕷皂苷對(duì)于矽塵導(dǎo)致肺組織纖維化的影響;使用羥脯胺酸測(cè)定、wes

5、tern blot(Collagen-Ⅰ、FN-1)、qRT-PCR(Col-1、Fn-1)和免疫組織化學(xué)方法(Collagen-Ⅰ)確定薯蕷皂苷對(duì)矽塵導(dǎo)致肺組織纖維化的影響;通過H&E染色觀察薯蕷皂苷對(duì)矽塵導(dǎo)致肺部炎癥的影響，應(yīng)用免疫熒光和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)薯蕷皂苷對(duì)于矽塵導(dǎo)致的肺部巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞聚集的影響;應(yīng)用ELISA和CBA技術(shù)檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液中相關(guān)細(xì)胞因子的含量。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠肺門淋巴結(jié)中不同

6、類型輔助型T細(xì)胞所占比例及小鼠肺組織中循環(huán)纖維細(xì)胞聚集情況。使用qRT-PCR方法檢測(cè)小鼠肺組織中Th細(xì)胞免疫和循環(huán)纖維細(xì)胞相關(guān)趨化因子mRNA表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、矽塵暴露小鼠肺組織中4-1BB蛋白表達(dá)增高。
　　與對(duì)照組相比，矽塵暴露小鼠肺組織中4-1BB蛋白表達(dá)增高。其中暴露后7天4-1BB蛋白表達(dá)增加770.86倍，暴露后56天4-1BB蛋白表達(dá)升高81.65倍。ELISA、western blot技

7、術(shù)、qRT-PCR和免疫組化檢測(cè)肺組織中4-1BB蛋白含量和mRNA表達(dá)情況，確定4-1BB在矽塵暴露組小鼠肺組織中高表達(dá)(p＜0.05)。
　　2、4-1BB融合蛋白阻斷4-1BB信號(hào)通路使ASK-1的磷酸化水平降低，NQDI1可以有效阻斷矽塵導(dǎo)致的肺部4-1BB信號(hào)通路激活。
　　通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明，給予矽塵暴露小鼠4-1BB融合蛋白，可以降低小鼠肺組織中ASK-1的磷酸化水平，并呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。給予

8、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NQDI1可以阻斷4-1BB信號(hào)通路，使信號(hào)通路下游蛋白p38和JNK的磷酸化水平下降，并且不影響實(shí)驗(yàn)小鼠血清中AST、ALT含量。
　　3、阻斷4-1BB信號(hào)通路可以減輕矽塵導(dǎo)致的肺部炎癥和纖維化。
　　使用ASK-1特異性抑制劑阻斷4-1BB信號(hào)通路后，矽塵暴露導(dǎo)致的肺部炎癥明顯減輕。阻斷4-1BB信號(hào)通路可以使矽塵暴露導(dǎo)致的肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，使小鼠肺泡灌洗液中炎性因子TNF-α含量降低(p＜0.05)，而

9、IL-6，IL-1β的含量不受影響。隨著疾病的進(jìn)展，Masson染色顯示矽塵暴露晚期（56天）模型組小鼠肺組織出現(xiàn)細(xì)胞結(jié)節(jié)和膠原沉積。阻斷4-1BB信號(hào)通路可使矽塵暴露導(dǎo)致的肺纖維化減輕。羥脯胺酸含量測(cè)定和qRT-PCR(Col-1a1)結(jié)果進(jìn)一步證明阻斷4-1BB信號(hào)通路可使矽塵暴露導(dǎo)致的肺纖維化減輕(p＜0.05)。
　　4、阻斷4-1BB信號(hào)通路可以影響肺部Th免疫應(yīng)答。
　　在炎癥早期，阻斷4-1BB信號(hào)通路可以使肺

10、門淋巴結(jié)中Th1細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例顯著降低(p＜0.05)。Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet的mRNA水平降低(p＜0.05)，小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的含量降低(p＜0.05)。矽塵暴露晚期，阻斷4-1BB信號(hào)通路可以使矽塵暴露小鼠肺組織中GATA3 mRNA水平降低(p＜0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠肺泡灌洗液中IL-13的含量有所下降，但差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IL-4水平并沒有因阻斷4-1BB信號(hào)通路而改變。與矽塵暴露

11、組相比，阻斷4-1BB信號(hào)通路可以使小鼠肺門淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例降低(p＜0.05); Realtime-PCR檢測(cè)Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ROR-γ T的mRNA水平也因阻斷4-1BB信號(hào)通路而下降(p＜0.05); ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠肺泡灌洗液中IL-17A的含量下降(p＜0.05)。矽塵暴露小鼠肺門淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例升高(p＜0.05)。阻斷4-1BB信號(hào)通路使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占的比例下

12、降(p＜0.05); CBA檢測(cè)結(jié)果顯示阻斷4-1BB信號(hào)通路后第3天和第7天小鼠肺泡灌洗液中IL-10含量沒有顯著變化，而在第56天有明顯下降(p＜0.05)。Realtime-PCR結(jié)果表明，阻斷4-1BB信號(hào)通路后第7天和第56天小鼠肺部TGF-β mRNA水平顯著下降(p＜0.05)。
　　5、阻斷4-1BB信號(hào)通路后纖維化減輕與循環(huán)纖維細(xì)胞向肺部聚集減少有關(guān)，相關(guān)趨化因子表達(dá)降低導(dǎo)致循環(huán)纖維細(xì)胞聚集減少。
　　流式

13、細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示阻斷4-1BB信號(hào)通路后，循環(huán)纖維細(xì)胞占肺組織細(xì)胞的比例下降(p＜0.05)。Realtime-PCR結(jié)果顯示矽塵暴露后小鼠肺組織中VCAM-1mRNA水平較對(duì)照組明顯上調(diào)(p＜0.05)，而ICAM-1的mRNA水平僅在矽塵暴露后7天顯著上調(diào)(p＜0.05)，而阻斷4-1BB信號(hào)通路并不能改變小鼠肺組織中兩分子mRNA水平。ELISA檢測(cè)肺組織中相關(guān)趨化因子的結(jié)果顯示矽塵暴露組小鼠與對(duì)照組小鼠相比，CCL-2、CCL-1

14、2和CCL-21顯著增高，而阻斷4-1BB信號(hào)通路后，這些趨化因子的含量均有所下降(p＜0.05)。阻斷信號(hào)通路也可以使SDF-1α的表達(dá)下降，但這種變化僅在第3天和第56天存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6、薯蕷皂苷可以減輕矽塵導(dǎo)致的肺部炎癥和纖維化。
　　羥脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果顯示，給予薯蕷皂苷的矽塵暴露組小鼠較矽塵暴露組小鼠肺組織中膠原沉積明顯降低(p＜0.05)。各組小鼠肺組織石蠟切片進(jìn)行Masson三色染色結(jié)果顯示給予矽塵暴露

15、小鼠薯蕷皂苷可以降低其肺部膠原沉積。Western blot結(jié)果顯示，給予薯蕷皂苷的矽塵暴露組小鼠較矽塵暴露組小鼠肺組織中Ⅰ型膠原蛋白和纖連蛋白水平有所下降(p＜0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示給予薯蕷皂苷的矽塵暴露組小鼠肺組織中Col-1a1和Fn-1 mRNA水平下降(p＜0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明Ⅰ型膠原蛋白在小鼠肺組織中的沉積隨給予薯蕷皂苷劑量的增加而減少(p＜0.05)。
　　7、薯蕷皂苷可以減輕矽塵導(dǎo)致的肺

16、部炎細(xì)胞的聚集。
　　H&E染色結(jié)果顯示，矽塵暴露組小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的肺部炎癥，而在給予薯蕷皂苷治療后肺部炎癥反應(yīng)減輕，并呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。ELISA和CBA方法檢測(cè)肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量，發(fā)現(xiàn)與矽塵暴露組相比，給予薯蕷皂苷治療的矽塵暴露組小鼠肺泡灌洗液中相關(guān)促炎因子含量減少，變化與給予薯蕷皂的劑量存在劑量反應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。qRT-PCR結(jié)果表明小鼠肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA

17、水平變化與之前ELISA檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)相一致。免疫熒光染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，矽塵暴露組小鼠肺組織切片中存在大量巨噬細(xì)胞聚集，而給予薯蕷皂苷使巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著下降。qRT-PCR結(jié)果顯示，給予高劑量(80 mg/kg)薯蕷皂苷的矽塵暴露組小鼠肺組織中CD68 mRNA水平明顯降低(p＜0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示，矽塵暴露肺組織中B淋巴細(xì)胞(B220+)數(shù)量明顯增加，給予薯蕷皂苷治療后矽塵暴露導(dǎo)致的B細(xì)胞聚集有所降低。免疫組化結(jié)果顯示矽塵暴露的肺

18、組織中T細(xì)胞聚集增加，薯蕷皂苷治療后T細(xì)胞聚集減少。
　　8、薯蕷皂苷可以調(diào)節(jié)矽塵誘導(dǎo)的肺部Th免疫應(yīng)答。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，矽塵暴露組和對(duì)照組相較，肺門淋巴結(jié)中Th1和Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例顯著增加，給予高劑量薯蕷皂苷后Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例有所下降。ELISA檢測(cè)肺泡灌洗液中相關(guān)炎性因子含量，結(jié)果表明給予薯蕷皂苷可以使矽塵暴露早期Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量降低(p＜0.05)，并可抑制

19、Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-13的表達(dá)(p＜0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示薯蕷皂苷可以使肺組織中Th1和Th2型細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3 mRNA水平降低(p＜0.05)。ELISA檢測(cè)表明與單純矽塵暴露組相比，給予薯蕷皂苷治療的矽塵暴露小鼠肺泡灌洗液中IL-17含量有所下降(p＜0.05)。
　　9、薯蕷皂苷的抗纖維化作用與循環(huán)纖維細(xì)胞向肺組織聚集減少有關(guān)。
　　免疫熒光結(jié)果顯示矽塵暴露組小鼠肺組織中

20、有較多循環(huán)纖維細(xì)胞聚集，給予薯蕷皂苷可以明顯減少矽塵暴露導(dǎo)致的循環(huán)纖維細(xì)胞聚集。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示矽塵暴露可以導(dǎo)致肺部循環(huán)纖維細(xì)胞聚集增加，而給予薯蕷皂苷可以使其聚集減少。qRT-PCR結(jié)果顯示給予薯蕷皂苷可以使肺組織中CCL12和CCL19 mRNA水平降低(p＜0.05)，而不能改變CCL21和CXCL12 mRNA水平。
　　10、薯蕷皂苷通過調(diào)控TGF-β-Smad3信號(hào)通路減輕矽塵對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的損傷。
　　H&E

21、染色結(jié)果顯示，矽塵暴露組小鼠給予薯蕷皂苷7天后，肺組織結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，肺組織矽塵暴露后EpCAM+FSP-1+雙陽細(xì)胞數(shù)量明顯增多，給予薯蕷皂苷治療使這部分雙陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(p＜0.05)。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)矽塵暴露組小鼠肺組織中上皮細(xì)胞標(biāo)記物Occludin(Ocln)、E-Cadherin(Cdh1)和Sf tpc mRNA水平較對(duì)照組明顯下降(p＜0.05)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin(Vim

22、)和FSP-1 mRNA表達(dá)水平明顯上升(p＜0.05);免疫熒光染色結(jié)果顯示矽塵暴露導(dǎo)致肺組織上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin表達(dá)減弱，而薯蕷皂苷治療可以恢復(fù)矽塵導(dǎo)致的上皮細(xì)胞標(biāo)記的損失。矽塵暴露小鼠肺組織中N-cadherin表達(dá)升高，給予薯蕷皂苷可以抑制其表達(dá)升高。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示矽塵暴露小鼠肺組織中Vimentin的表達(dá)升高，而給予薯蕷皂苷可以劑量依賴性的減少其表達(dá)。
　　qRT-PCR結(jié)果表明薯蕷皂苷

23、處理能夠降低矽塵暴露小鼠肺組織中Tgfβ mRNA水平(p＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示矽塵暴露小鼠肺組織蛋白中TGF-β表達(dá)升高，給予薯蕷皂苷可以降低其表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示薯蕷皂苷處理可以抑制矽塵誘導(dǎo)的肺部Smad3磷酸化，而不影響總Samd3水平。
　　流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示矽塵暴露組小鼠肺門淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯升高(p＜0.05)，薯蕷皂苷治療可以降低其比例(p＜0.05)。q

24、RT-PCR結(jié)果顯示薯蕷皂苷處理可以明顯降低矽塵暴露組小鼠肺組織中IL-10和Foxp3mRNA水平(p＜0.05)。
　　結(jié)論:1、矽塵暴露小鼠肺組織中4-1BB蛋白表達(dá)增高。2、阻斷4-1BB信號(hào)通路可以減輕矽塵導(dǎo)致的肺部炎癥和纖維化。3、阻斷4-1BB信號(hào)通路可以減輕肺部Th免疫應(yīng)答和循環(huán)纖維細(xì)胞向肺部的聚集進(jìn)而減輕肺纖維化。4、薯蕷皂苷通過減少巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞向肺部的聚集，減輕肺部炎癥。5、薯蕷皂苷通過調(diào)節(jié)