桂枝加葛根湯對大鼠頸椎間盤維環(huán)細胞蛋白多糖表達的影響.pdf

1、目的:
　　 為了探討桂枝加葛根湯治療頸椎病的的作用機理研究,建立大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞體外培養(yǎng)體系,采用不通濃度的桂枝加葛根湯大鼠含藥血清進行分組干預,從分子水平及超微結構水平觀察桂枝加葛根湯通過影響纖維環(huán)細胞,探索其與纖維環(huán)退變關系,進而深化桂枝加葛根湯治療頸椎病的的臨床治療作用,間接促進中藥治療頸椎病的臨床推廣應用。
　　 方法:
　　 (1)將80只清潔級成年SD大鼠按體質量(200～230g)隨機分為4組

2、,即空白組(20只)采用2mL生理鹽水灌胃;中藥低劑量組(20只)采用1mL桂枝加葛根湯藥液灌胃;中藥中劑量組(20只)采用2mL桂枝加葛根湯藥液灌胃;中藥高劑量組(20只)采用4mL桂枝加葛根湯藥液灌胃。各組連續(xù)灌胃4天(2次/天),制備不同濃度的桂枝加葛根湯大鼠含藥血清。
　　 (2)通過酶消化法貼壁分離體外培養(yǎng)大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞,采用甲苯胺藍染色、免疫細胞化學染色和透射電鏡觀察對其進行表型鑒定。
　　 (3)采

3、用自制桂枝加葛根湯含藥血清對纖維環(huán)細胞進行分組干預,連續(xù)干預6天。利用透射電鏡觀察桂枝加葛根湯干預后纖維環(huán)細胞形態(tài)及結構的變化;采用熒光定量PCR測定各組纖維環(huán)細胞Aggrecan-mRNA表達的變化。
　　 結果:
　　 (1)纖維環(huán)細胞的體外培養(yǎng)和鑒定:培養(yǎng)的細胞具有甲苯胺藍異染性;Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原單克隆抗體檢測到培養(yǎng)的細胞有Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原的陽性表達;光鏡觀察細胞多呈近圓形、梭形或多角形,胞質內可見較多粗面內質

4、網(wǎng);透射電鏡下觀察細胞結構符合軟骨細胞特點。
　　 (2)透射電鏡下觀察不同濃度桂枝加葛根湯含藥血清干預后各組纖維環(huán)細胞超微結構變化:中、高劑量組細胞內粗面內質網(wǎng)較空白組及低劑量組明顯增多,出現(xiàn)電子密度較大的蛋白質沉淀,以高劑量組最為明顯。
　　 (3)熒光定量PCR檢測桂枝加葛根湯含藥血清干預后纖維環(huán)細胞中蛋白多糖Aggrecan-mRNA的表達變化:中、高劑量組Aggrecan-mRNA表達的Ct值明顯高于空白組(P

5、＜0.05),低劑量組Ct值與空白組比較無明顯差異,而高劑量組Ct值明顯高于中劑量組(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.采用酶消化法成功貼壁分離培養(yǎng)了纖維環(huán)細胞,完成對細胞的表型鑒定,符合纖維環(huán)細胞的特征,為后續(xù)的實驗提供了前提條件。
　　 2.桂枝加葛根湯含藥血清使纖維環(huán)細胞超微結構發(fā)生改變:中、高劑量組使纖維環(huán)細胞粗面內質網(wǎng)和核糖體數(shù)量增多,蛋白沉淀增多,這提示桂枝加葛根湯從細胞結構上增強蛋白分泌的能