納米硒的體內(nèi)外生物效應(yīng)研究.pdf

1、硒是人類和動(dòng)物所必需的微量元素，以硒代半胱氨酸的形式位于多種硒蛋白的催化部位發(fā)揮其生理作用，但其營(yíng)養(yǎng)范圍很窄，過量攝入會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生一定的毒性。而納米硒作為一種有別于普通無機(jī)硒和有機(jī)硒的新型硒形式，因其特殊的理化特性而受到廣泛關(guān)注，但是目前關(guān)于納米硒生物學(xué)效應(yīng)的研究結(jié)果各異，相關(guān)代謝作用機(jī)制仍沒有完全清楚。體外Caco-2細(xì)胞模型和模式動(dòng)物斑馬魚已被廣泛用以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝和生物學(xué)效應(yīng)研究。鑒于此，本文運(yùn)用Caco-2細(xì)胞體外模型和蛋白組學(xué)

2、技術(shù)比較研究了納米硒相較于其它形式硒（Se-Met和Na2SeO3）在細(xì)胞中的代謝差異，運(yùn)用斑馬魚模式生物進(jìn)行體內(nèi)納米硒的急性毒性研究，旨在深入探究納米硒相對(duì)于普通無機(jī)硒和有機(jī)硒的獨(dú)特生物學(xué)效應(yīng)及其產(chǎn)生機(jī)制，為納米硒的應(yīng)用奠定一定理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、結(jié)合粒徑分析技術(shù)，探究了制備不同粒徑納米硒的不同方法。運(yùn)用多糖模板法制備得到了平均粒徑在130nm左右的納米硒粒子，運(yùn)用蛋白質(zhì)模板法制備得到了平均粒徑分別在25 nm

3、、40nm和80 nm左右的納米硒粒子，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用了蛋白質(zhì)模板法制備納米硒。
　　2、建立Caco-2細(xì)胞模型進(jìn)行了三種形式硒（Nano-Se、Se-Met和Na2SeO3）在模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取試驗(yàn)。37℃下，相同濃度（0.1μmol/L）的三種形式硒在模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取在AP-BL和BL-AP兩個(gè)方向上都是呈現(xiàn)時(shí)間（2h內(nèi)）依賴。到2h為止，Caco-2細(xì)胞對(duì)Nano-Se和Se-Met的轉(zhuǎn)運(yùn)率（分別為9.11±3.09％和7

4、.33±2.36％）要顯著高于Na2SeO3（1.84±0.64％）(P＜0.05)，而Nano-Se和Se-Met之間的差異不顯著;同時(shí)，Caco-2細(xì)胞對(duì)Nano-Se的攝取率（8.36±1.70％）顯著高于Se-Met(4.75±0.41％)和Na2SeO3(0.99±0.14％)(P＜0.05)，且Se-Met和Na2SeO3之間也是差異顯著的(P＜0.05)。在37℃下，Na2SeO3跨Caco-2細(xì)胞單層的表觀通透系數(shù)Pap

5、p(AP-BL和BL-AP)都要顯著小于其他兩種形式的硒(P＜0.05)，而Nano-Se和Se-Met之間沒有顯著差異，且所有的Papp(AP-BL)/Papp(BL-AP)(R)都處在0.99-1.06之間，沒有顯著差異。
　　3、結(jié)合雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析研究了不同形式硒(Nano-Se、Se-Met和Na2SeO3)處理前后Caco-2細(xì)胞的蛋白質(zhì)組差異，經(jīng)過PDQuest軟件分析得到了30個(gè)差異顯著的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜

6、分析鑒定得到了7個(gè)涉及細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、能量代謝、抗氧化性能等方面的有生物學(xué)意義的差異蛋白，分別為磷酸丙酮異構(gòu)酶(TSP isomerase)、T-復(fù)雜的蛋白質(zhì)1亞基ζ(TCPZ)、核纖層蛋白B1(Lamin-B1)、異質(zhì)核核糖核蛋白F(hnRNP F)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](Cu，Zn-SOD)、泛素結(jié)合酶E2K(E2K)和谷胱甘肽合成酶(GS)。按對(duì)照、亞硒酸鈉、硒代蛋氨酸和納米硒的順序，TSP isomerase、TCPZ、L

7、amin-B1、hnRNP F和Cu，Zn-SoD的表達(dá)具有不同程度的下調(diào)趨勢(shì)，而E2 K和GS的表達(dá)具有不同程度的上調(diào)趨勢(shì)，并且除E2 K外，納米硒對(duì)其它蛋白的表達(dá)調(diào)控呈現(xiàn)與硒代蛋氨酸相似的作用效果。
　　4、以硒代蛋氨酸為參比，進(jìn)行了納米硒對(duì)斑馬魚胚胎的毒性研究，得到了納米硒對(duì)斑馬魚胚胎具有致畸效應(yīng)，不同濃度硒溶液暴露會(huì)使斑馬魚胚胎產(chǎn)生包括體軸彎曲（AM）、心包水腫(PE)、卵黃囊水腫(YES)、游囊膨脹不全(USB)、死亡等

8、典型畸型。隨著硒濃度及作用時(shí)間的增加，納米硒和硒代蛋氨酸誘導(dǎo)斑馬魚死亡的胚胎數(shù)以及畸形的胚胎數(shù)都呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，通過計(jì)算得出納米硒在96 hpf的LC50為7.18μmol/L，在120 hpf的LC50為5.68μmol/L; DL-硒代蛋氨酸在96 hpf的LC50為67.32μmol/L，在120 hpf的LC50為54.66μmol/L。此外，在120 hpf時(shí)納米硒的TC50為3.27μmol/L，而DL-硒代蛋氨酸的TC50為

9、44.22μmol/L。
　　5、選用幾種關(guān)鍵酶作為分子指標(biāo)研究了不同濃度納米硒對(duì)其活力的影響。納米硒暴露下，按照0μmol/L、2μmol/L、6μmol/L的順序，斑馬魚胚胎的堿性磷酸酶(AKP)活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且三組之間差異顯著(P＜0.05);同時(shí)，酸性磷酸酶(ACP)和Na+K+-ATPase活力也呈現(xiàn)略微的下降趨勢(shì)，但三組之間差異不顯著(P＞0.05);谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)活力是0μmol/L和2μmol/