BafilomycinA1對鈷納米顆粒所致體內(nèi)外不良生物學(xué)效應(yīng)保護作用的實驗研究.pdf

1、第一部分Bafilomycin A1抑制鈷納米顆粒誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞細胞毒性和促炎細胞因子的釋放的實驗研究
　　目的：研究Bafilomycin A1對鈷納米顆粒（CoNPs）誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞細胞毒性和炎癥反應(yīng)的保護作用。
　　方法：
　?。?）采用不同濃度的CoNPs、Co2+和Bafilomycin A1對RAW264.7細胞進行甲基噻唑基四唑（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法

2、檢測細胞生存率；
　?。?）通過對照組、CoNPs組、低劑量藥物組、高劑量藥物組四組 MTT分析方法檢測細胞生存率比較，評估Bafilomycin A1對CoNPs細胞毒性的抑制作用；
　?。?）采用 DAPI對RAW264.7細胞核進行染色，熒光顯微鏡觀察細胞數(shù)量的變化；
　?。?）掃描電鏡觀察各組RAW264.7細胞超微形態(tài)學(xué)的變化；（5）采用ELISA法檢測前炎癥因子TNF-α、IL-1β、 IL-6的表達情況。

3、
　　結(jié)果：
　　（1） CoNPs及 Co2+對RAW264.7細胞的細胞毒性效應(yīng)呈現(xiàn)時間、濃度依賴性；Bafilomycin A1（8nM，16nM）對RAW264.7細胞沒有細胞毒性；CoNPs和Co2+細胞毒性的起效濃度分別約為50、400μM；
　　（2）隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高 RAW264.7細胞的細胞毒性逐漸減弱（P<0.05）；
　　（3）熒光顯微鏡觀察隨著Bafilomy

4、cin A1作用濃度的增高RAW264.7細胞數(shù)量逐漸增加；
　?。?）掃描電鏡觀察顯示CoNPs組的RAW264.7細胞偽足基本消失，且細胞明顯縮?。浑S著Bafilomycin A1作用濃度的增高RAW264.7細胞的偽足逐漸增多，且細胞鋪展面積逐漸與對照組接近；
　?。?）隨著 Bafilomycin A1作用濃度的增高炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達逐漸減弱（P<0.05）。
　　結(jié)論：CoNPs對R

5、AW264.7細胞的細胞毒性效應(yīng)強于 Co2+；Bafilomycin A1（8nM，16nM）沒有細胞毒性。Bafilomycin A1對CoNPs所致RAW264.7細胞的細胞毒性和炎癥反應(yīng)具有保護作用。
　　第二部分Bafilomycin A1抑制鈷納米顆粒誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞向破骨細胞分化的實驗研究
　　目的：研究探索Bafilomycin A1對CoNPs誘導(dǎo)的RAW264.7細胞分化的影響。
　　方法：

6、>　?。?） RAW264.7細胞培養(yǎng)第5d，通過倒置相差顯微鏡觀察活體破骨細胞形態(tài)改變、TRAP染色、TRAP染色陽性細胞計數(shù)，從細胞形態(tài)學(xué)上來評估Bafilomycin A1抑制CoNPs誘導(dǎo)巨噬細胞向破骨細胞分化的作用；
　?。?）培養(yǎng)第6d通過 Real-time PCR檢測破骨細胞基因表達從基因水平來評估Bafilomycin A1抑制CoNPs誘導(dǎo)巨噬細胞向破骨細胞分化的作用。
　　結(jié)果：
　　（1）培養(yǎng)第

7、5d，通過倒置相差顯微鏡觀察，CoNPs組不規(guī)則細胞數(shù)量增加，體積增大，多核細胞亦增多，其內(nèi)的細胞核也增多。隨著 Bafilomycin A1作用濃度的增加，多核細胞數(shù)目逐漸減少，多核細胞體積逐漸變?。煌ㄟ^TRAP染色，CoNPs組有大量TRAP染色陽性的破骨細胞形成，隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加，TRAP染色陽性的破骨細胞數(shù)目逐漸減少（p<0.05）。
　　（2）培養(yǎng)第6dReal-time PCR檢測破骨細胞

8、基因TRAP、RANK及Cath-K的表達，所得結(jié)果規(guī)律性與活體破骨細胞形態(tài)改變、TRAP染色結(jié)果一致。
　　結(jié)論：小鼠RAW264.7細胞能夠被RANKL誘導(dǎo)生成破骨細胞，CoNPs能夠加速誘導(dǎo)巨噬細胞向破骨細胞分化，Bafilomycin A1能夠抑制CoNPs誘導(dǎo)巨噬細胞向破骨細胞分化的進程，呈劑量依賴性。
　　第三部分Bafilomycin A1對鈷納米顆粒誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞不良生物學(xué)效應(yīng)保護作用的機制研究
　

9、　目的：研究 pH值對CoNPs溶解的影響，通過H+-ATPase抑制劑Bafilomycin A1抑制RAW264.7對細胞內(nèi)的CoNPs溶解的影響、TEM超微結(jié)構(gòu)改變及氧化應(yīng)激水平的影響，初步探討B(tài)afilomycin A1對CoNPs所致體內(nèi)外不良生物學(xué)效應(yīng)保護作用的機制。
　　方法：
　?。?）通過ICP-MS測量 CoNPs在不同 pH值培養(yǎng)基中釋放 Co2+的水平；
　　（2）各實驗組細胞通過 ICP-MS

10、測量及 EDX能譜測試，評估Bafilomycin A1抑制細胞內(nèi)CoNPs溶解作用；
　　（3）利用TEM觀察各組RAW264.7細胞超微結(jié)構(gòu)的改變；
　?。?）收集各組RAW264.7細胞抽提液，通過GSH/GSSG、SOD、CAT、GPx水平檢測，評估 Bafilomycin A1抑制細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的作用。
　　結(jié)果：
　　（1）培養(yǎng)基中離子釋放呈現(xiàn)時間、pH值依賴關(guān)系，各時間點釋放的濃度均小于 Co2+細

11、胞毒性起效濃度；
　?。?）細胞內(nèi) CoNPs離子釋放呈現(xiàn)時間依賴關(guān)系，隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加，細胞內(nèi)CoNPs離子釋放逐漸減少（P<0.05）；
　　（3）CoNPs組RAW264.7細胞內(nèi)溶酶體和濾泡的數(shù)目急劇增多，CoNPs被溶酶體吞噬，伴有細胞器消失；隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高，RAW264.7細胞內(nèi)溶酶體和濾泡的數(shù)目逐漸減少，同時消失的細胞器再次出現(xiàn)；
　?。?）C

12、oNPs組 GSH、SOD、GPx、CAT水平明顯降低，隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高，GSH、SOD、GPx、CAT水平相應(yīng)升高。
　　結(jié)論： CoNPs的溶解度在細胞外環(huán)境中很低，在細胞內(nèi)低 pH值環(huán)境的溶酶體中更容易溶解釋放大量鈷離子，從而破壞細胞抗氧化防御機制，引起氧化應(yīng)激損傷，是CoNPs引起細胞毒性反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及誘導(dǎo)破骨細胞分化等一系列不良生物學(xué)反應(yīng)的根本原因。
　　第四部分Bafilomyci

13、n A1抑制鈷納米顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨周圍急性炎癥反應(yīng)和骨溶解作用的實驗研究
　　目的：研究Bafilomycin A1對CoNPs誘導(dǎo)的小鼠顱骨周圍急性炎癥反應(yīng)和骨溶解作用的影響。
　　方法：
　?。?）建立小鼠顱骨周圍急性炎癥反應(yīng)和骨吸收注射模型，各組顱骨周圍軟組織病理學(xué)切片染色觀察及炎癥細胞計數(shù)分析；
　?。?）各組顱骨病理學(xué)切片染色觀察及骨組織計量學(xué)數(shù)據(jù)測量；
　　（3）各組 Micro-CT分析；（

14、4）各組顱骨周圍軟組織促炎細胞因子的測量。
　　結(jié)果：
　　（1）顱骨周圍軟組織病理學(xué)切片染色觀察及炎癥細胞計數(shù)分析結(jié)果提示CoNPs組細胞浸潤最密集，滿視野均是核染成深藍色巨噬細胞或淋巴細胞，隨著 Bafilomycin A1作用濃度的增加，炎性細胞浸潤數(shù)目逐漸減少（p<0.05）。
　　(2)顱骨病理學(xué)切片染色觀察及骨組織計量學(xué)數(shù)據(jù)測量結(jié)果提示CoNPs組的樣本可見顱骨骨吸收明顯，伴炎性細胞浸潤。隨著 Bafilo

15、mycin A1作用濃度的增加，骨吸收破壞范圍減小，溶解面積減小，炎性細胞浸潤數(shù)目逐漸減少。
　　(3)Micro-CT分析結(jié)果提示CoNPs組骨吸收明顯、隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加，骨吸收破壞范圍減小。隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加BMD和BMC顯著升高(P<0.05)。
　?。?）顱骨周圍軟組織促炎細胞因子表達結(jié)果提示 CoNPs組軟組織內(nèi) TNF-α、IL-1β及 IL-6蛋白表達量