急性高血壓條件下足細(xì)胞整合素β1及FAK表達(dá)變化的研究.pdf

1、足細(xì)胞是位于腎小球基底膜(Glomerular basement membrane，GBM)外側(cè)的終末分化期細(xì)胞。它是蛋白尿漏出的最后一道屏障，所以足細(xì)胞損傷可以產(chǎn)生蛋白尿[1]。在許多人類及動(dòng)物腎小球疾病模型中已證實(shí)足細(xì)胞的損傷，高血壓腎損傷就是其中之一。
　　 作為足細(xì)胞和GBM之間的重要黏附分子，整合素α3β1的減少是蛋白尿產(chǎn)生的重要原因之一。整合素α3β1是一類細(xì)胞表面的糖蛋白，它是由α與β兩種亞基通過(guò)非共價(jià)鍵構(gòu)成，其中

2、α亞基相對(duì)β亞基大[5]。在不同的外界刺激作用下，整合素α3β1結(jié)合不同的配體，包括層黏連蛋白(Laminin)、纖維連接蛋白(fibronectin)和膠原(collagen)，從而向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)不同的信號(hào)[6]。這是以細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)、整合素α3β1和骨架蛋白組成的焦點(diǎn)黏附物為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)的。許多信號(hào)蛋白通過(guò)與焦點(diǎn)黏附物結(jié)合，在整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。局部黏附激酶(Focal Ad

3、hesion Kinase，F(xiàn)AK)就是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的信號(hào)蛋白，它是一個(gè)非受體型酪氨酸激酶。酪氨酸397位點(diǎn)是FAK的重要磷酸化位點(diǎn)，它是通過(guò)一些激活蛋白（如整合素的胞漿端等）取代FERM區(qū)域的位置從而破壞了FERM和激酶區(qū)之間的自身抑制作用實(shí)現(xiàn)的。已有報(bào)道，磷酸化的FAK在足細(xì)胞損傷過(guò)程中明顯增加，而且抑制FAK的激活可以減少蛋白尿的產(chǎn)生和足細(xì)胞的融合[7]。在高血壓心力衰竭動(dòng)物模型中，人們發(fā)現(xiàn)FAK和磷酸化FAK的表達(dá)明顯增加并表

4、現(xiàn)出明顯的核內(nèi)聚集[8，9]。但是這些發(fā)現(xiàn)都是在慢性疾病中或者制造動(dòng)物模型后很長(zhǎng)時(shí)間觀察到的。而在異常血流動(dòng)力學(xué)變化早期腎小球整合素β1以及FAK的瞬間表達(dá)變化還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 血流動(dòng)力學(xué)因素對(duì)小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能等方面具有重要的影響[10-12]，且其影響瞬息萬(wàn)變，需要應(yīng)用一種能瞬間捕獲組織細(xì)胞原位變化的技術(shù)來(lái)反映活體內(nèi)真實(shí)的病理生理狀態(tài)。使用傳統(tǒng)的固定組織方法是難以實(shí)現(xiàn)的[13]。而采用“活體冷凍技術(shù)”(in vivo cr

5、yotechnique，IVCT)結(jié)合冷凍置換方法能使活體小鼠腎臟內(nèi)所有生物進(jìn)程被即刻停止。我們課題組已成功應(yīng)用IVCT觀察到異常血流動(dòng)力學(xué)條件下血清蛋白在腎小球中的分布變化[14]。以上研究充分說(shuō)明活I(lǐng)VCT是一項(xiàng)觀察異常血流動(dòng)力學(xué)條件下腎小球結(jié)構(gòu)和功能變化的可靠方法。
　　 本研究應(yīng)用IVCT結(jié)合免疫組化、共聚焦顯微鏡、免疫電鏡、western blot等技術(shù)觀察異常血流動(dòng)力學(xué)條件下整合素β1和FAK的變化，為進(jìn)一步闡明蛋白

6、尿的產(chǎn)生機(jī)制提供依據(jù)。
　　 目的：
　　 本研究旨在探討不同血流動(dòng)力學(xué)條件下足細(xì)胞基底膜黏附蛋白整合素β1、相關(guān)信號(hào)分子FAK的分布變化，為進(jìn)一步闡明蛋白尿的產(chǎn)生機(jī)制，尋求新的蛋白尿的治療方法提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明小鼠20只，體重20-30克，雌雄不限，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組:
　　 (1)應(yīng)用IVCT固定的正常血流組
　　

7、 (2)應(yīng)用IVCT固定的急性高血壓組（結(jié)扎小鼠左側(cè)腎動(dòng)脈下的腹主動(dòng)脈10分鐘）
　　 (3)應(yīng)用IVCT固定的停止血流組（腹腔一次性注入超劑量戊巴比妥鈉致使心臟驟停，導(dǎo)致血液循環(huán)停止）
　　 (4)侵潤(rùn)固定正常血流組及直接切除快速冷凍組（對(duì)照組）
　　 3.應(yīng)用HE染色、免疫組化DAB顯色、間接免疫熒光及免疫電鏡技術(shù)觀察腎小球的結(jié)構(gòu)變化以及整合素β1和FAK的動(dòng)態(tài)變化，應(yīng)用western blot技術(shù)對(duì)上述蛋白

8、進(jìn)行定量分析，同時(shí)應(yīng)用免疫組化DAB顯色法觀察酪氨酸397磷酸化FAK(pTyr397FAK)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同血流動(dòng)力學(xué)條件下腎小球的結(jié)構(gòu)變化:在正常血流動(dòng)力學(xué)條件下，腎小囊呈裂隙狀，毛細(xì)血管較光滑飽滿;而在急性高血壓條件下，腎小囊和腎小管變得更加擴(kuò)張;相反，在停止血流組以及浸潤(rùn)固定正常血流的條件下，腎小球毛細(xì)血管襻閉塞。另外，在活體冷凍固定組的腎小球毛細(xì)血管內(nèi)均可見(jiàn)不同數(shù)量的紅細(xì)胞存在，而在侵潤(rùn)固

9、定組幾乎未見(jiàn)紅細(xì)胞存在。
　　 2.足細(xì)胞整合素β1、FAK與pTyr397FAK在腎小球的分布變化:正常血流條件下，整合素β1沿著基底膜呈線性分布，分布均勻;FAK和pTyr397FAK在足細(xì)胞的胞漿和胞核中均勻分布。在急性高血壓條件下，三者的表達(dá)均明顯減少，整合素β1呈斷續(xù)分布，部分染色缺失;在異常血流組和浸潤(rùn)固定組FAK和pTyr397FAK的表達(dá)進(jìn)一步減少并出現(xiàn)不均勻表達(dá)。而整合素β1在浸潤(rùn)固定組較活體冷凍組的表達(dá)明顯增

10、多。共聚焦顯微鏡進(jìn)一步證明了整合素β1和FAK在足細(xì)胞的分布，同時(shí)可以看到兩者共同表達(dá)位點(diǎn)在異常血流動(dòng)力學(xué)條件下減少且不均勻。
　　 3.急性高血壓條件下足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析及整合素β1、FAK的分布和表達(dá)變化:急性高血壓條件下，足細(xì)胞足突出現(xiàn)不同程度的融合，并且出現(xiàn)整合素β1從足突側(cè)部向基底部，F(xiàn)AK從胞漿向胞核的移位聚集現(xiàn)象。
　　 4.不同血流動(dòng)力學(xué)條件下整合素β1、FAK的定量分析:在急性高血壓、停止血流和直接切除

11、組上述蛋白表達(dá)均明顯減少(P＜0.05)。而且FAK在異常血流動(dòng)力學(xué)條件下表現(xiàn)出明顯核內(nèi)聚集現(xiàn)象，其中直接切除組的變化最大。
　　 結(jié)論：
　　 1.急性高血壓能夠造成足細(xì)胞損傷，致使足突融合，整合素β1和FAK的異位表達(dá)。
　　 2.異常血流動(dòng)力學(xué)條件可導(dǎo)致整合素β1、FAK蛋白在腎臟的表達(dá)減少。
　　 3.整合素β1、FAK、pTyr397FAK的分布和表達(dá)變化，在調(diào)節(jié)異常血流動(dòng)力學(xué)條件下的足細(xì)胞功能