獸疫鏈球菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因功能研究.pdf

1、獸疫鏈球菌（Streptococcuszooepidemicus）是目前工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)的主要菌株。UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase)主要催化UTP和葡萄糖-1-磷酸合成UDP-葡萄糖。UDP-葡萄糖作為葡萄糖基供體，參與多種寡糖和多糖的生物合成，是合成其他核苷二磷酸單糖的前體物質(zhì)，在糖代謝過程和HA合成過程中起著重要作用。

2、r>　　本論文以S.zooepidemicus ATCC39920為研究對(duì)象，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過序列BLAST發(fā)現(xiàn)S.zooepidemicus中存在兩個(gè)UGPase基因，hasC1和hasC2。對(duì)兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄情況研究表明兩個(gè)基因在不同生長階段均能正常轉(zhuǎn)錄。
　　(2)以溫度敏感型自殺載體pSET4s為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建敲除系統(tǒng)，成功獲得基因缺失菌株△hasC1、△hasC2和△hasC1△hasC2。表型分析發(fā)現(xiàn)

3、，△hasCl△hasC2在THB培養(yǎng)基上生長緩慢且無莢膜產(chǎn)生。在添加有半乳糖和甘露糖的培養(yǎng)基中，基因缺失菌株△hasC1△hasC2不能回復(fù)表型缺陷。
　　(3)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，HasC1和HasC2二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致，均由多個(gè)α-螺旋、β-折疊和線性結(jié)構(gòu)組成。以Sphingomonas elodea ATCC31461 UGPase為模板同源建模預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)HasC1和HasC2同樣包含三個(gè)核心結(jié)構(gòu)域:碳端結(jié)構(gòu)域、中

4、心結(jié)構(gòu)域（活性位點(diǎn)所在區(qū)域）和氮端結(jié)構(gòu)域。Sphingomonas elodeaATCC31461 UGPase與HasC1和HasC2具有高度同源性，所預(yù)測的三級(jí)結(jié)構(gòu)基本能真實(shí)反映S.zooepidemicus UGPase空間構(gòu)象，為迸一步探究UGPase結(jié)構(gòu)和功能提供理論依據(jù)。
　　(4)體外酶活分析結(jié)果表明，在37℃反應(yīng)條件下，HasC1較HasC2具有更高的酶活力，分別為HasC11.1 U/mg，HasC20.78U/

5、mg。蛋白的C-端較蛋白的N-端對(duì)酶活性具有更重要的作用。
　　(5)本研究通過建立HPLC分析檢測方法，對(duì)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物UDP-Glc和UDPGlcUA進(jìn)行了定量分析。研究表明，hasC1和hasC2基因的缺失導(dǎo)致UDP-Glc和UDP-GlcUA含量降低。此外，在發(fā)酵過程中分別對(duì)菌株的生長、乳酸產(chǎn)量、HA產(chǎn)量和蔗糖消耗等進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示hasC1和hasC2基因的缺失對(duì)菌體生長和HA合成有一定的影響，且hasC