馬鏈球菌獸疫亞種可能的毒力基因的發(fā)現(xiàn)及分布.pdf

1、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ)為蘭氏分群中的C群鏈球菌，能引起豬的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎以及突發(fā)性死亡。馬鏈球菌獸疫亞種危害集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，同時(shí)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的相關(guān)從業(yè)人員的健康具有潛在威脅。馬鏈球菌獸疫亞種的全基因組測(cè)序工作尚未完成，新的毒力基因有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)以SEZ強(qiáng)毒株ATCC35246和弱毒疫苗株ST171為研究對(duì)象，利用SSH技術(shù)分析了

2、其基因組之間的差異，發(fā)現(xiàn)了15個(gè)可能的毒力基圖片段，并對(duì)其中6個(gè)毒力基因片段在其他鏈球菌上的分布進(jìn)行了研究。 為了獲得馬鏈球菌獸疫亞種毒力菌株特有的基因片段，將強(qiáng)毒菌株ATCC35246與弱毒疫苗株ST171進(jìn)行抑制性差減雜交。提取兩株細(xì)菌基因組DNA, RsaI酶切回收?；厥盏腁TCC35246基因組分別連接兩個(gè)不同的接頭，經(jīng)過(guò)兩輪雜交、兩輪PCR擴(kuò)增后，得到ATCC35246特有的基因序列。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物并連接至PMD-18

3、T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10鋪氨芐平板，獲得約800個(gè)克隆.隨機(jī)挑取296個(gè)克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定，擴(kuò)增出一系列100-2000 bp大小的片段。 將得到的296個(gè)陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物變性固定于尼龍膜，分別與地高辛標(biāo)記過(guò)的ATCC35246和ST171酶切基因組DNA進(jìn)行雜交，斑點(diǎn)雜交結(jié)果得到20個(gè)有差異的PCR樣品，并將其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果遞交GenBank進(jìn)行同源性查找，發(fā)現(xiàn)了15個(gè)可能的新的毒力基因片段。這些基因編碼的

4、蛋白和酶可能與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、分子合成、能量代謝、調(diào)控蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及其他一些未知的功能有關(guān)，這在國(guó)內(nèi)外尚屬首次報(bào)道。 選擇其中6個(gè)具有代表性的片段序列設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR檢測(cè)這些片段在其他16株鏈球菌上的分布。結(jié)果表明，這6個(gè)片段在ATCC35246上均能檢出，而在ST171上僅檢出一例，證明了PCR結(jié)果具有較高的可靠性，在其他馬鏈球菌獸疫亞種菌株中，這6個(gè)片段都有很廣泛的分布，在其他血清型的鏈球菌中也有一定的分布，而在豬鏈球