馬鏈球菌獸疫亞種可能的毒力基因的發(fā)現(xiàn)及分布.pdf

1、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ)為蘭氏分群中的C群鏈球菌，能引起豬的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎以及突發(fā)性死亡。馬鏈球菌獸疫亞種危害集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，同時對養(yǎng)豬業(yè)的相關(guān)從業(yè)人員的健康具有潛在威脅。馬鏈球菌獸疫亞種的全基因組測序工作尚未完成，新的毒力基因有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。本實驗以SEZ強毒株ATCC35246和弱毒疫苗株ST171為研究對象，利用SSH技術(shù)分析了

2、其基因組之間的差異，發(fā)現(xiàn)了15個可能的毒力基圖片段，并對其中6個毒力基因片段在其他鏈球菌上的分布進(jìn)行了研究。 為了獲得馬鏈球菌獸疫亞種毒力菌株特有的基因片段，將強毒菌株ATCC35246與弱毒疫苗株ST171進(jìn)行抑制性差減雜交。提取兩株細(xì)菌基因組DNA, RsaI酶切回收?；厥盏腁TCC35246基因組分別連接兩個不同的接頭，經(jīng)過兩輪雜交、兩輪PCR擴增后，得到ATCC35246特有的基因序列。擴增PCR產(chǎn)物并連接至PMD-18

3、T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10鋪氨芐平板，獲得約800個克隆.隨機挑取296個克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定，擴增出一系列100-2000 bp大小的片段。 將得到的296個陽性克隆的PCR產(chǎn)物變性固定于尼龍膜，分別與地高辛標(biāo)記過的ATCC35246和ST171酶切基因組DNA進(jìn)行雜交，斑點雜交結(jié)果得到20個有差異的PCR樣品，并將其進(jìn)行測序，測序結(jié)果遞交GenBank進(jìn)行同源性查找，發(fā)現(xiàn)了15個可能的新的毒力基因片段。這些基因編碼的

4、蛋白和酶可能與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、分子合成、能量代謝、調(diào)控蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白以及其他一些未知的功能有關(guān)，這在國內(nèi)外尚屬首次報道。 選擇其中6個具有代表性的片段序列設(shè)計引物，運用PCR檢測這些片段在其他16株鏈球菌上的分布。結(jié)果表明，這6個片段在ATCC35246上均能檢出，而在ST171上僅檢出一例，證明了PCR結(jié)果具有較高的可靠性，在其他馬鏈球菌獸疫亞種菌株中，這6個片段都有很廣泛的分布，在其他血清型的鏈球菌中也有一定的分布，而在豬鏈球