PGG及其腸道菌群降解產(chǎn)物的生物活性分析.pdf

1、水解類鞣質(zhì)1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-Penta-O-Galloyl-Beta-D-glucose，PGG），廣泛存在于果蔬、中草藥植物中，具有多種生物活性，對人體有免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)保健作用。本團隊前期研究從桉樹葉中提取分離出PGG，也證明了其抗氧化、抗腫瘤、抗衰老作用，但是PGG在人體中的消化情況、降解途徑及降解產(chǎn)物尚不明確，有待進一步研究。本文首先對PGG抗氧化和抗腫瘤進行研究;然后擬采用人體腸道菌群對P

2、GG進行體外厭氧發(fā)酵，分離純化和結構鑒定它的降解中間產(chǎn)物和終端產(chǎn)物，明確降解途徑;通過制備色譜等方法將PGG重要的降解產(chǎn)物分離純化，對其進行初步抗氧化活性評價，為深入探索PGG生物活性作用機理提供基礎。本論文的研究內(nèi)容和所得結果如下：
　?。?）PGG的體外抗氧化活性化學研究。本文采用清除 DPPH、ABTS自由基及ORAC-FL法評價其抗氧化能力。結果表明：PGG具有良好的抗氧化活性，能有效、快速地抑制溶液中 DPPH和 ABT

3、S自由基，且其抗氧化活性明顯優(yōu)于 Vc和 Trolox,說明PGG具有較強的抗氧化活性。
　?。?）PGG的體外抗氧化活性細胞研究。本文建立了PC12細胞氧化損傷模型，探究PGG對PC12細胞增殖的影響及降低H2O2損傷PC12細胞的效果。結果表明：在25~100μg/mL濃度范圍內(nèi),PGG對PC12細胞沒有毒性；經(jīng)PGG處理的PC12損傷細胞存活率提高，因此，PGG對細胞損傷具有明顯的保護作用。
　?。?）PGG的抗腫瘤活

4、性研究。選用HCT-116細胞作為研究對象，用不同濃度的PGG處理HCT-116細胞，采用MTT法測定細胞存活率，流式細胞儀檢測細胞周期、細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度PGG處理的HCT-116的增殖受到了抑制，并且有劑量依賴性；同時結腸癌S期細胞數(shù)量有所增加，說明PGG可引起S期阻滯。此外,早期凋亡的數(shù)量大幅上升，說明PGG可以有效地引起結腸癌細胞的凋亡。
　?。?）PGG的制備與其在模擬胃腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性研究。將在實驗室制備

5、得到的PGG，通過HPLC檢測純度，然后加入到人工胃液pH=1.2及人工腸液pH=7.4中，確定PGG在人工胃腸液中的穩(wěn)定性。結果表明：分離純化的PGG高效液相色譜檢測其純度＞95％，可用于后續(xù)試驗。在0～6h中，PGG在模擬胃液pH緩沖液中的穩(wěn)定性良好，在模擬腸液pH環(huán)境中稍微降解，但2h后也趨于穩(wěn)定。結果表明，PGG在酸性環(huán)境弱堿性環(huán)境中均較穩(wěn)定。
　?。?）PGG在腸道菌群的厭氧降解研究。配制培養(yǎng)液進行腸道菌群的體外厭氧培養(yǎng)

6、，將一定濃度PGG加入腸道菌群培養(yǎng)液中，在37℃下厭氧培養(yǎng)一定時間。取不同時間段的發(fā)酵液，通過離心分離菌，上清用乙酸乙酯提取，干燥提取液，用HPLC檢測提取物。所得結果如下：主要為7種化合物，按照降解的先后順序依次命名為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7。PGG發(fā)酵24h后完全降解為P7，即降解終端產(chǎn)物，且隨PGG濃度增加，P7的濃度也增加。在1h-24h之間隨時間的增長P1-P6（降解中間產(chǎn)物）及P7（終端產(chǎn)物）的量也隨之變化。

7、
　?。?）PGG的單寧酶酶解結果驗證。為了驗證PGG在腸道菌群中的降解可能與腸道菌群釋放的酶有關，用可以酶解PGG的單寧酶進行酶解，乙酸乙酯提取，干燥提取液，用HPLC檢測提取物，液相圖譜與PGG腸道菌群發(fā)酵液的液相圖譜進行對比。結果顯示：單寧酶酶解PGG和PGG發(fā)酵液的液相對比圖顯示，PGG酶解產(chǎn)物與PGG發(fā)酵降解產(chǎn)物的液相對比圖中的P1-P6出峰順序一致，出峰時間均相同，單寧酶酶解PGG的終端產(chǎn)物為P6，由此分析，PGG的腸

8、道菌群降解可能與菌群分泌的單寧酶有關，而菌群發(fā)酵產(chǎn)物中P6屬于中間產(chǎn)物，P7才是終端產(chǎn)物，因此菌群發(fā)酵液中不只有單寧酶作用于PGG降解，還可能能存在其他酶的作用。
　?。?）PGG降解產(chǎn)物的分離純化和結構鑒定。采用制備色譜分離富集7個PGG降解產(chǎn)物，以ESI-MS檢測產(chǎn)物，得到各物質(zhì)的分子量，推測可能的分子結構。用制備高效液相色譜對PGG降解產(chǎn)物進行分離純化和富集，采用ESI-MS確定分離純化出來的各化合物分子量，結果顯示：PGG

9、降解產(chǎn)物的分子量依次為788、636、484、332、170、126，其中P2和P3的分子量均為636，二者可能為同分異構體，而P1和P2(3)、P4、P5之間分子量依次相差一個沒食子酸殘基（152），由此推測可能的化合物名稱依次為為TGG(4GG)、TriGG（3GG）、DGG(2GG)、MGG(1GG)；P6和P7均符合沒食子酸和鄰苯三酚的分子量大小，經(jīng)與標準物質(zhì)比較，確定P6為沒食子酸(GA)，P7為鄰苯三酚（PGA）。P1到P5

10、的物質(zhì)結構還有待進一步確定。
　?。?）PGG降解產(chǎn)物的抗氧化活性檢測。用清除DPPH、清除ABTS自由基和ORAC法進行降解產(chǎn)物的抗氧化活性評價，結果顯示：清除DPPH自由基法中，清除率達50%時，各化合物所需濃度TriGG＞DGG＞PGG＞TGG＞GA＞MGG＞PGA，DGG與TriGG的IC50值差異不大。在清除ABTS自由基中，所有降解產(chǎn)物IC50均小于PGG。ORAC法顯示，自由基吸收能力GA＞PGG＞PGA＞MGG，而