Cphy3367基因重組丙丁梭菌發(fā)酵纖維素產(chǎn)丁醇研究.pdf

1、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）是目前工業(yè)中使用的生物發(fā)酵丁醇生產(chǎn)菌株，這個菌株本身具有完整的纖維素酶系，包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶，但是這個菌株卻無法利用纖維素作為原料進行生長和丙酮丁醇的發(fā)酵。
　　 本研究從厭氧梭菌Clostridium phytofermentans中克隆cphy3367基因，構(gòu)建大腸桿菌-梭菌穿梭質(zhì)粒pSOS95-cphy3367。在大腸桿菌XL1-b

2、lue中利用酶切、PCR方法篩選出成功重組的表達載體。并通過目的基因轉(zhuǎn)錄熒光實時定量PCR、目的蛋白酶活測定的方法在RNA和蛋白水平上證明了來源于厭氧梭菌C.acetobutylicum ATCC824的硫解酶啟動子能夠在大腸桿菌宿主中行使啟動子功能。
　　 重組表達載體pSOS95-cphy3367甲基化后通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入丙酮丁醇梭菌，成功構(gòu)建出重組丙酮丁醇梭菌ATCC824/pSOS95-cphy3367。利用濾紙纖維素作

3、為直接碳源對于重組菌株與原始野生菌株ABE發(fā)酵能力進行對比研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn):野生菌株ATCC824不能利用濾紙纖維素進行ABE發(fā)酵產(chǎn)溶劑;含有空載體的對照組重組菌株ATCC824/pSOS95del能夠利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，說明空載體的轉(zhuǎn)入影響了菌株代謝途徑，提高了丙酮丁醇梭菌ABE發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的能力;含有目的基因的重組菌株ATCC824/pSOS95-cphy3367能夠發(fā)酵產(chǎn)生丙酮、乙醇和丁醇，并且各溶劑產(chǎn)量都高于對照菌株ATCC8

4、24/pSOS95del，證明目的基因的重組導(dǎo)入提高了丙酮丁醇梭菌菌株對于纖維素原料的利用能力。
　　 進一步，對重組菌株與野生菌株利用蔗渣水解液進行發(fā)酵的情況進行研究。結(jié)果表明:野生菌株ATCC824的發(fā)酵液中無乙醇產(chǎn)生;重組菌株ATCC824/pSOS95del發(fā)酵能夠產(chǎn)生乙醇，但是丙酮、丁醇產(chǎn)量低于野生菌株;而重組菌株ATCC824/pSOS95-cphy3367發(fā)酵產(chǎn)物溶劑中丙酮、乙醇、丁醇量分別為0.78 g/L、0.