衰老小鼠巨噬細胞microRNA表達及其調控機制研究.pdf

1、衰老是一個多方面衰退并呈現(xiàn)疾病傾向的生理過程,盡管有越來越多的證據(jù)表明miRNA(microRNA)參與對衰老的調節(jié),但是對它在巨噬細胞中與年齡相關的表達變化及其調控機制還知之甚少。與年齡相關的免疫紊亂表現(xiàn)為細胞因子如TNFα和IL-6等的表達水平升高和對感染的敏感性增加。因此,miRNA作為在轉錄后水平上基因表達的重要調節(jié)因子,對其深入研究有助于我們更好地了解免疫衰老的機制,并可為延緩衰老提供新的策略。
　　 本論文分析了年輕

2、及自然衰老小鼠巨噬細胞在炎癥應答過程中miRNA的差異表達譜,使用LNA標記的芯片技術,鑒定出各自的差異表達miRNA,在衰老小鼠巨噬細胞中,16個miRNA的表達與LPS刺激無關,但在年輕組中卻表現(xiàn)為上調或下調；對其中miR-146a、miR-223、miR-28和miR-101a進行了q-PCR驗證,結果與芯片結果基本一致,提示這些差異miRNA的表達可能與巨噬細胞的免疫衰老密切相關；利用生物信息學軟件對這些差異miRNA的靶基因進

3、行了預測,并通過GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)生物信息學分析,對這些靶基因進行了生物過程、分子功能、細胞組分以及信號通路方面的注釋,并建立起免疫、凋亡以及轉錄因子和表觀遺傳學三個方面的miRNA-gene相互作用網絡圖,結果表明,這些靶基因參與了17條重要信號通路的調節(jié)。
　　 通過芯片和real time PCR的鑒定,我們發(fā)現(xiàn)衰老

4、小鼠巨噬細胞中miR-146a具有較高的表達水平,且在體內及體外均對LPS刺激缺乏免疫應答。由于在衰老小鼠巨噬細胞中miR-146a對LPS和促炎因子刺激均無反應,我們推測miR-146a的表達調控有其他調節(jié)機制,且其表達異常與炎癥細胞因子表達異常有關；對miR-146a的調控機制研究發(fā)現(xiàn),NF-κB與pre-miR-146a(primary miR-146a)啟動子區(qū)結合異常導致了miR-146a在小鼠腹腔巨噬細胞中的表達異常；表觀遺

5、傳學研究顯示,衰老小鼠巨噬細胞中,DNA甲基化及組蛋白乙?；鶇⑴cmiR-146a的表達調控。組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑TSA(trichostatin A)可顯著提高衰老小鼠的巨噬細胞中NF-κB的活性和NF-κB p65與miR-146a啟動子的結合能力,且HDAC表達水平比年輕小鼠巨噬細胞高。Real time PCR檢測發(fā)現(xiàn)LPS處理小鼠腹腔巨噬細胞24小時的過程中,衰老小鼠細胞中HDAC1-11個亞型的mRNA表達相對

6、于年輕小鼠表現(xiàn)出更明顯的變化趨勢,但各個時間點的整體表達均比年輕小鼠高,說明高表達的HDAC顯著抑制了衰老小鼠巨噬細胞miR-146a的表達。
　　 我們進一步探討了miR-146a對巨噬細胞Th1/Th2類細胞因子表達的影響,以miR-146a mimics、陰性對照mimics(NC mimics)、抑制性miR-146a(miR-146ainhibitor)和抑制性miR-146a陰性對照(NC inhibitor)分別瞬

7、時轉染體外培養(yǎng)的小鼠單核-巨噬細胞RAW264.7以及腹腔新鮮分離的原代巨噬細胞,利用real time PCR定量檢測IL-18、IL-5和IL-10的表達情況,結果證實,miR-146a能夠負向調控Th1類細胞因子IL-18的表達,但是不能調控Th2類細胞因子IL-5及IL-10的表達。
　　 結論:本文鑒定了衰老小鼠巨噬細胞差異表達的miRNA,分析了其靶基因及其功能,證實miR-146a等的表達異?？蓪е滤ダ闲∈缶奘杉毎?/p>