CD4+LAP+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在動脈粥樣硬化中作用及機制研究.pdf

1、第一部分 CD4+LAP+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在動脈粥樣硬化小鼠中數(shù)量與功能變化
　　目的：研究動脈粥樣硬化（AS）模型小鼠體內(nèi)潛伏相關(guān)肽（LAP）+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+LAP+Tregs）的數(shù)量與功能變化。
　　方法：將6周大小雄性的C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠分為3組：1）10-wk C57BL/6J組（即C57BL/6J小鼠普通飲食4周）；2）10-wk ApoE-/-組（即ApoE-/-小鼠普通飲食4周）；3）

2、20-wk ApoE-/-組（即ApoE-/-小鼠普通飲食14周）。飼養(yǎng)一定時間后摘眼球取血、分離脾臟和胸腺組織。檢測血漿總膽固醇、oxLDL和甘油三酯的含量。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟和胸腺中CD4+CD25+LAP+細(xì)胞及CD4+CD25-LAP+Tregs細(xì)胞的比例。應(yīng)用3H-胸腺嘧啶核甘（3H-TdR）滲入法檢測脾臟的CD4+LAP+是否能夠抑制CD4+LAP-的增殖反應(yīng)。應(yīng)用ELISA法檢測CD3抗體刺激后脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-

3、17和IFN-γ的濃度。
　　結(jié)果：10-wk ApoE-/-組血漿總膽固醇和ox-LDL濃度顯著高于同齡的10-wkC57BL/6J組，20-wk ApoE-/-組總膽固醇和ox-LDL濃度明顯高于10-wk ApoE-/-組。10-wk ApoE-/-組胸腺和脾臟中 CD4+CD25+LAP+和 CD4+CD25-LAP+ Tregs比例明顯低于10-wk C57BL/6J組，20-wk ApoE-/-組胸腺和脾臟中CD4+C

4、D25+LAP+和CD4+CD25-LAP+Tregs比例明顯低于10-wk ApoE-/-組。此外，20-wk ApoE-/-組脾臟CD4+LAP+Tregs抑制功能顯著低于10-wk ApoE-/-組和10-wkC57BL/6J組，而10-wk ApoE-/-組與10-wkC57BL/6J組無明顯差異。20-wk ApoE-/-組脾細(xì)胞表達(dá)IFN-γ和IL-17明顯高于10-wk ApoE-/-組和10-wk C57BL/6J組。<

5、br>　　結(jié)論：動脈粥樣硬化小鼠血漿脂質(zhì)水平明顯高于正常小鼠。在動脈粥樣硬化小鼠中，CD4+LAP+Tregs數(shù)量顯著下降和功能明顯受損，且體內(nèi)炎癥因子表達(dá)明顯增高。
　　第二部分去除 CD4+LAP+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)和小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成
　　目的：通過構(gòu)建動脈粥樣硬化模型，觀察和探討 anti-LAP抗體是否能夠去除 CD4+LAP+Tregs，及其對動脈粥樣硬化斑塊形成和免疫炎癥反應(yīng)的影響。
　

6、　方法：將6周大小雄性的ApoE-/-小鼠分為2組：1）IC對照組（即ApoE-/-小鼠經(jīng)腹腔注射50μg IgG1同型抗體，每天一次，連續(xù)五天，高脂飲食12周）；2）anti-LAP組（即ApoE-/-小鼠經(jīng)腹腔注射50μg anti-LAP抗體，每天一次，連續(xù)五天，高脂飲食12周）。上述抗體干預(yù)于第9、12、15周重復(fù)，18周齡時分離血、脾臟、心臟、全主動脈。抗體干預(yù)24h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞（即Fo

7、xp3+Tregs）和CD4+LAP+Tregs比例，應(yīng)用3H-TdR滲入法檢測Foxp3+Tregs的功能變化和脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，分離脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清并應(yīng)用ELISA檢測IL-17和IFN-γ的濃度。動脈粥樣硬化模型建立后，分離血漿并檢測甘油三酯和總膽固醇的含量，油紅O染色評估主動脈竇和全主動脈斑塊面積，免疫組化染色檢測主動脈竇斑塊 collagen、TGF-β、CD4、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、α-SMA、CD68和

8、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的含量，應(yīng)用流式測定脾臟中Th1（CD4+IFN-γ+）細(xì)胞、Th17（CD4+IL-17+）細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 M1、M2的百分比，應(yīng)用 RT-PCR法檢測動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)VCAM-1、IL-10、TGF-β、IL-17、MCP-1和IFN-γmRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果：與IC對照組相比，anti-LAP組脾臟CD4+LAP+細(xì)胞被去除了70％，而Foxp3+Tregs細(xì)胞的數(shù)量及功能并不受影響。

9、anti-LAP組與IC對照組相比，脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力明顯升高，且其IFN-γ和IL-17的蛋白表達(dá)明顯增加。另外，IC對照組和anti-LAP組的甘油三酯和總膽固醇濃度無明顯區(qū)別。與IC對照組相比，anti-LAP組主動脈竇和全主動脈斑塊面積明顯增加，anti-LAP組斑塊內(nèi)TGF-β、collagen和α-SMA含量顯著減少，而CD4數(shù)量、CD68、MMP-2和MMP-9的含量均明顯增加。anti-LAP組與IC對照組相比，脾臟T

10、h17、Th1和M1細(xì)胞的數(shù)量增多，而M2細(xì)胞則下降。此外，anti-LAP能夠顯著上調(diào)主動脈VCAM-1、IFN-γ、IL-17和MCP-1 mRNA的含量，而下調(diào)TGF-β和IL-10 mRNA的含量。
　　結(jié)論：經(jīng)腹腔注射anti-LAP抗體可有效去除ApoE-/-小鼠免疫器官中CD4+LAP+Tregs細(xì)胞。anti-LAP抗體能夠促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊形成和斑塊不穩(wěn)定，其機制為anti-LAP抗體能夠去除 CD4+LAP+

11、細(xì)胞和下調(diào)抗炎因子 TGF-β及 IL-10，從而導(dǎo)致炎癥因子IL-17、IFN-γ和MCP-1等顯著增加。
　　第三部分過繼轉(zhuǎn)輸 CD4+LAP+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞減輕免疫炎癥反應(yīng)和小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成
　　目的：通過構(gòu)建動脈粥樣硬化模型，觀察和探討過繼轉(zhuǎn)輸CD4+LAP+ Tregs細(xì)胞對動脈粥樣硬化斑塊形成和免疫炎癥反應(yīng)的影響。
　　方法：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分選C57BL/6J小鼠脾臟的CD4+LAP+Tregs和C

12、D4+LAP-效應(yīng)性T細(xì)胞（Teffs）用于過繼轉(zhuǎn)輸和表型功能分析。流式檢測上述兩種細(xì)胞的純度、LAP+細(xì)胞與Foxp3+細(xì)胞重疊比例、以及CD4+LAP+Tregs細(xì)胞表面CTLA-4和ICOS的表達(dá)水平。分離CD4+LAP+Tregs和CD4+LAP-Teffs細(xì)胞的上清并應(yīng)用ELISA檢測TGF-β和IL-10的濃度。另外，將6周大小雄性的ApoE-/-小鼠分為3組：1）PBS對照組（即ApoE-/-小鼠經(jīng)尾靜脈注射200μl P

13、BS）；2）LAP+細(xì)胞組（即經(jīng)尾靜脈注射1×105個CD4+LAP+ Tregs）；3）LAP-細(xì)胞組（即經(jīng)尾靜脈注射1×105個CD4+LAP- Teffs）。上述干預(yù)于第9、12、15周重復(fù)，總共四次。經(jīng)過12周高脂飲食，18周齡時分離血、脾臟、心臟、全主動脈。應(yīng)用3H-TdR滲入法檢測脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，分離脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清并應(yīng)用ELISA檢測IL-17和IFN-γ的濃度。檢測血漿甘油三酯和總膽固醇含量。油紅O染色評估主動

14、脈竇和全主動脈斑塊面積，免疫組化染色檢測主動脈竇斑塊 TGF-β、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、CD4、α-SMA、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、CD68和collagen的含量，應(yīng)用流式測定脾臟中Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 M1、M2的百分比，應(yīng)用 RT-PCR法檢測動脈粥樣硬化斑塊內(nèi) IL-17、VCAM-1、TGF-β、MCP-1、IFN-γ和IL-10 mRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果：經(jīng)流式分選，CD4+LA

15、P+細(xì)胞和CD4+LAP-細(xì)胞純度分別可以達(dá)到90.5%和96%，經(jīng)鑒定LAP+細(xì)胞幾乎不含F(xiàn)oxp3。而且，CD4+LAP+細(xì)胞表面CTLA-4和ICOS的表達(dá)水平明顯高于CD4+LAP-細(xì)胞，以及前者分泌TGF-β和IL-10顯著高于后者。另外，與PBS對照組相比，LAP+細(xì)胞組脾臟淋巴細(xì)胞增殖明顯受抑，且IFN-γ和IL-17的蛋白表達(dá)明顯減少。三組之間的總膽固醇和甘油三酯水平無明顯差異。與 PBS對照組相比，LAP+細(xì)胞組主動脈

16、竇和全主動脈斑塊面積明顯減少，LAP+細(xì)胞組斑塊內(nèi)TGF-β、α-SMA和collagen含量顯著增加，而CD68、CD4、MMP-2和MMP-9數(shù)量或表達(dá)明顯減少。與PBS對照組相比，LAP+細(xì)胞組脾臟Th1、Th17、M1細(xì)胞比例明顯減少，而M2則顯著增加。此外，過繼轉(zhuǎn)輸LAP+細(xì)胞能夠上調(diào)主動脈IFN-γ、IL-17、MCP-1和VCAM-1 mRNA的含量，同時可下調(diào)TGF-β和IL-10 mRNA的含量。
　　結(jié)論： C