補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD55、CD59在動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)研究.pdf

1、研究目的：
　　利用高脂飲食誘導(dǎo)的載脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠為動(dòng)脈粥樣硬化模型，探討補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白中膜輔助蛋白（membrane cofactor protein,CD46）、衰變加速因子（decay accelerating factor,CD55）、膜反應(yīng)性溶解抑制物（membrane inhibitor of reactive lysis,CD59）在動(dòng)脈粥樣硬化（atheroscle

2、rosis，AS）中的表達(dá)。
　　研究?jī)?nèi)容和方法：
　　1、構(gòu)建小鼠AS模型
　　8只5周齡體重在18-22g雄性SPF級(jí)C57BL/6J載脂蛋白E基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)組（FS組），8只相同周齡及體重范圍雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠為對(duì)照組（NS組）。兩組小鼠正常飼料喂養(yǎng)1周后，分別予高脂飼料喂養(yǎng)(1％膽固醇+15%豬油)。
　　在高脂喂養(yǎng)15周后，收集實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。小鼠空腹過夜，經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，摘除眼

3、球收集血液標(biāo)本，并凍存。用冷PBS沖洗左側(cè)心腔及動(dòng)脈腔內(nèi)的殘血后，鈍性分離自主動(dòng)脈瓣至腹主動(dòng)脈分叉處的主動(dòng)脈節(jié)段，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定小鼠血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)含量。將主動(dòng)脈縱向剖開后釘于蠟板上，觀察主動(dòng)脈段內(nèi)膜是否有淺黃色斑塊形成，再進(jìn)行蘇丹IV染色以觀察內(nèi)膜脂紋形成情況。對(duì)主動(dòng)脈行石蠟切片，HE染色鏡下觀察血管是否有泡沫細(xì)胞及脂核或脂質(zhì)池形成。綜合以上指標(biāo)判斷ApoE基因敲除小鼠

4、AS模型是否構(gòu)建成功。
　　2、檢測(cè)AS病變血管免疫復(fù)合物-IgG的沉積
　　建立高脂飲食誘導(dǎo)的AS動(dòng)物模型后，于無菌操作臺(tái)上分離主動(dòng)脈。取主動(dòng)脈瓣至升主動(dòng)脈的主動(dòng)脈段，予4%中性甲醛固定并做石蠟包埋。切片后，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)血管壁免疫復(fù)合物-IgG。探討AS病變血管是否存在免疫反應(yīng)。
　　3、檢測(cè)AS病變血管補(bǔ)體C3(complement3,C3)和膜攻擊復(fù)合物（membrane attack complex,M

5、AC）的表達(dá)
　　上述主動(dòng)脈段蠟塊，切片后，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)血管壁補(bǔ)體C3、MAC蛋白的表達(dá)。探討AS病變血管是否存在補(bǔ)體激活。
　　4、檢測(cè)AS病變血管補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白中CD46、CD55及CD59的表達(dá)
　　上述主動(dòng)脈段蠟塊，切片后，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)血管壁補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD55及CD59的表達(dá)。探討AS病變血管是否存在補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)。
　　5、檢測(cè)AS外周血單個(gè)核細(xì)胞補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD5

6、5及CD59的表達(dá)
　　收集NS組和FS組小鼠的血液，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取總蛋白，應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD55及CD59的表達(dá)。探討AS外周血單個(gè)核細(xì)胞是否存在補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1、小鼠AS模型的評(píng)價(jià)
　　1.1、體重變化：高脂飼養(yǎng)15周后，NS組和FS組小鼠體重?zé)o明顯差異。（WT：29.10±2.53g vs.33.20±5.18g P＞0.

7、05）。
　　1.2、血清總膽固醇變化：FS組較NS組小鼠血清總膽固醇顯著增高(TC：13.52±1.58 mEq/L vs.2.12±0.35 mEq/L P＜0.01)。
　　1.3、血管病理改變：NS組主動(dòng)脈內(nèi)膜平整、光滑，無脂質(zhì)沉積；FS組主動(dòng)脈內(nèi)膜面有淡黃色斑塊狀隆起，散在或融合成片，以主動(dòng)脈瓣口至升主動(dòng)脈處最為明顯。
　　1.4、蘇丹IV染色：NS組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，無著色呈現(xiàn)內(nèi)膜本色；FS組主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊狀

8、隆起處被染成猩紅色，無斑塊處呈現(xiàn)內(nèi)膜本色，紅白分明。表明FS組主動(dòng)脈內(nèi)膜在大體標(biāo)本上出現(xiàn)明顯的AS斑塊。
　　1.5、HE染色：NS組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑、完整、無增厚，內(nèi)皮下無脂質(zhì)沉積，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊；FS組主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，可見脂質(zhì)斑塊形成，斑塊內(nèi)有大量泡沫細(xì)胞，管腔明顯狹窄，中膜平滑肌細(xì)胞顯著紊亂。表明 FS組主動(dòng)脈形成 AS斑塊。
　　綜上結(jié)果：顯示該模型指標(biāo)符合動(dòng)脈粥樣硬化的表現(xiàn)，AS模型構(gòu)建成功。
　　

9、2、AS病變血管免疫復(fù)合物-IgG的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示：與NS組比較，F(xiàn)S組小鼠主動(dòng)脈壁免疫復(fù)合物-IgG（平均光密度值：90.77±40.44 vs.0.96±0.15，P＜0.01，）表達(dá)顯著增高，表明AS病變血管出現(xiàn)免疫反應(yīng)。
　　3、AS病變血管C3和MAC的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示：與NS組比較，F(xiàn)S組小鼠主動(dòng)脈壁補(bǔ)體C3（平均光密度值：261.5±68.02 vs.2.00±1.44，P＜0.01

10、）和MAC（平均光密度值：135.08±89.60 vs.8.79±3.59，P＜0.01）蛋白表達(dá)均顯著增高。表明AS病變血管有補(bǔ)體激活。
　　4、AS病變血管CD46、CD55及CD59的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示：與NS組比較，F(xiàn)S組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)CD46（平均光密度值：24.14±0.25 vs.0.39±0.09，P＜0.01）、CD55（平均光密度值：55.23±2.85 vs.10.04±3.76，P＜0.01）

11、和CD59（平均光密度值：38.08±0.68 vs.0.07±0.02，P＜0.01）蛋白表達(dá)均顯著增高。表明AS病變血管補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD55、CD59激活。
　　5、AS外周血單個(gè)核細(xì)胞CD46、CD55及CD59的表達(dá)
　　蛋白免疫印跡法的結(jié)果顯示，NS、FS兩組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞CD59蛋白低表達(dá)，未能檢測(cè)出。與NS組比較，F(xiàn)S組中CD46蛋白的表達(dá)無明顯差異（灰度值：76.92±1.54 vs.92.3

12、5±9.62，P＞0.05）；而CD55蛋白表達(dá)有顯著下降（灰度值：6.97±3.71 vs.29.60±10.91，P＜0.01）。這表明在AS模型中外周血單個(gè)核細(xì)胞補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD55、CD59表達(dá)無增加。
　　結(jié)論：
　　本研究顯示：在高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE基因敲除小鼠AS模型中，動(dòng)脈粥樣硬化血管存在免疫反應(yīng)、補(bǔ)體激活和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（CD46、CD55、CD59）激活；但外周血單個(gè)核細(xì)胞補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（CD46