淺玫瑰色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的工藝優(yōu)化及放大.pdf

1、殼聚糖物理與化學(xué)性質(zhì)及潛在的多種生物活性，在食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)與養(yǎng)殖業(yè)等方面具有廣闊的前景。但殼聚糖低水溶性限制了其應(yīng)用的開發(fā)。殼聚糖酶是一類能催化氨基葡萄糖間的β-1,4-糖苷鍵斷裂，從而專一性降解殼聚糖的糖苷水解酶。殼寡糖作為殼聚糖水解產(chǎn)物，保留了殼聚糖的生理生化活性且具有良好的水溶性。酶解法制備殼寡糖具有低成本、低能耗、高產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)，目前制備殼寡糖的主要方法是酶解法。
　　本文所用殼聚糖酶生產(chǎn)菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離篩選獲得

2、的一株淺玫瑰鏈霉菌(Streptomyces roseolus DH)，具有產(chǎn)酶量高、發(fā)酵周期短及單一內(nèi)切型酶等特點(diǎn)，有潛力成為工業(yè)化生產(chǎn)菌株。本實(shí)驗(yàn)研究該菌株的10L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝，考察攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、接種量及種齡對(duì)發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的影響。在控制發(fā)酵條件不變的情況下，采用單因素試驗(yàn)分別考察攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、接種量及種齡對(duì)淺玫瑰色鏈霉菌發(fā)酵的影響。根據(jù)各因素對(duì)產(chǎn)酶的影響，確定10L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝條件：攪拌轉(zhuǎn)速250rpm，接種量3％，通

3、氣量2.0vvm，種齡OD600=0.8-1.0。發(fā)酵周期56小時(shí)，酶活力在52小時(shí)達(dá)到最高，為35.2±0.5U/mL。淺玫瑰色鏈霉菌在批次發(fā)酵過程中出現(xiàn)二次生長(zhǎng)現(xiàn)象，第一次攝氧高峰菌體利用發(fā)酵液中易利用的碳源生長(zhǎng)，第二次攝氧高峰為菌體在殼聚糖的誘導(dǎo)下產(chǎn)生殼聚糖酶分解利用殼聚糖生長(zhǎng)。
　　通過分析發(fā)酵過程中菌體干重、攝氧速率及菌絲形態(tài)與酶活力的關(guān)系，提出補(bǔ)糖發(fā)酵工藝和補(bǔ)料工藝。補(bǔ)糖工藝能顯著提高發(fā)酵液中的菌體量，從而提高發(fā)酵產(chǎn)酶

4、。但過高的葡萄糖量可能會(huì)形成葡萄糖效應(yīng)，影響菌株的產(chǎn)酶量。研究顯示，與批次發(fā)酵相比，在發(fā)酵液中補(bǔ)加1%的葡萄糖，發(fā)酵液中菌體量增加了11.3%，酶活力增加了12%，其發(fā)酵周期56小時(shí)，酶活力在48小時(shí)達(dá)到最高，為39.4±0.5U/mL。在發(fā)酵穩(wěn)定期補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基，能有效增加發(fā)酵過程中產(chǎn)酶期時(shí)間，從而提高產(chǎn)酶。與批次發(fā)酵相比，補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)酶期時(shí)間延長(zhǎng)33.3%，發(fā)酵周期64小時(shí)，酶活力在60小時(shí)達(dá)到最高，為46.4±0.5U/mL，比批次

5、發(fā)酵增長(zhǎng)了32%。淺玫瑰色鏈霉菌發(fā)酵過程中菌絲變化明顯。在批次發(fā)酵中，菌體在進(jìn)入產(chǎn)酶期時(shí)菌絲密集旺盛，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體干重減少，菌絲減少且變細(xì)。穩(wěn)定期補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基，不僅能增加產(chǎn)酶期時(shí)間，在一定程度上維持了菌體的代謝強(qiáng)度和菌絲的生長(zhǎng)。
　　考慮到淺玫瑰色鏈霉菌對(duì)剪切環(huán)境敏感，以體積傳氧系數(shù)和攪拌葉片線速度為放大準(zhǔn)則，根據(jù)發(fā)酵罐相似的幾何尺寸，計(jì)算100L發(fā)酵罐發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm，通氣量0.8vvm。在此條件下，接入