宏基因組文加中鹵化酶及酯酶的篩選與分析.pdf

1、土壤是地球上生物多樣性最好的生態(tài)系統(tǒng)，1克土壤就包含了數(shù)以百萬計(jì)的微生物。微生物是生物活性天然產(chǎn)物（如抗生素、抗癌藥物、生物酶）的主要來源之一。然而，只有不超過1％的微生物可以在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下被培養(yǎng)。將整個(gè)土壤基因組看成一個(gè)單元而不是先培養(yǎng)微生物，這種方法就是宏基因組方法，而這整個(gè)土壤基因組就是宏基因組。采用宏基因組方法，將不可培養(yǎng)的微生物的基因轉(zhuǎn)入可培養(yǎng)微生物，進(jìn)而進(jìn)行基因功能研究與天然產(chǎn)物表達(dá)，可以發(fā)掘新的基因和天然產(chǎn)物資源。通過

2、采集云南的土壤樣品，經(jīng)直接裂解提取環(huán)境高分子量總DNA，離心、電泳純化去除腐殖質(zhì)，透析、濃縮后獲得可用于構(gòu)建文庫的eDNA。本次研究中，構(gòu)建了10，000，000克隆數(shù)的YNF3文庫和100，000克隆數(shù)的YNF8文庫。YNF3和YNF8文庫的插入片段大小平均值分別為約37.3 kb和38.2 kb。
　　許多天然產(chǎn)物中的鹵素取代基深刻影響著其生物活性，天然產(chǎn)物的鹵化過程通常由鹵化酶催化，通過對鹵化酶基因簇進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析可以初步

3、推斷產(chǎn)生化合物的可能性。通過篩選含有鹵化酶基因的單克隆為探索產(chǎn)生鹵化物的潛力打下基礎(chǔ)，在YNF3和YNF8文庫中采用序列篩選來尋找鹵化酶基因，最終獲得16個(gè)鹵化酶相關(guān)單克隆。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明16個(gè)單克隆的基因簇存在著產(chǎn)生化合物的可能性。
　　酯酶屬于水解酶的一類，善于分解短鏈水溶性的脂肪酸酯（小于10個(gè)碳原子），在不同領(lǐng)域有很多應(yīng)用，例如食品中的脂肪改性以提高口感和營養(yǎng)價(jià)值，去除紙漿中的瀝青，作為洗滌劑中的添加劑，生物柴油的生

4、產(chǎn)等。通過功能性篩選，在YNF8文庫中獲得了新型酯酶EstGX1，并對其生化特性進(jìn)行了研究。EstGX1的偏好底物為C4，而幾乎不水解C14，這表明EstGX1是一個(gè)羧酸酯酶。EstGX1最適pH為9.0，是一個(gè)堿性酯酶。EstGX1最適溫度為46.4℃，同時(shí)，EstGX1在4℃下具有20％以上的相對活性。EstGX1在50℃保溫50 min后仍具有60％以上的相對活性。EstGX1對部分表面活性劑（例如Tween-20、Triton