栗樹林土壤微生物宏基因組文庫(kù)中新型酯酶的功能篩選及其鑒定分析.pdf

1、羧酸酯水解酶，主要催化酯類化合物的水解反應(yīng)和合成反應(yīng)。脂肪酶和酯酶是脂解酶的兩個(gè)主要的家族。在某些條件惡劣的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，由于其固有的熱穩(wěn)定性和耐有機(jī)溶劑的功能，并結(jié)合其較高的化學(xué)選擇性，區(qū)域選擇性和對(duì)映體選擇性，使酯類水解酶在各種工業(yè)應(yīng)用中成為了非常有吸引力的生物催化劑。同時(shí)，從極端微生物來(lái)源的酶還可能擁有一些額外的功能，例如在極高或極低的溫度，極端的pH值或高鹽度的水平下活動(dòng)，這一點(diǎn)可能引起某些有特定目的的產(chǎn)業(yè)的興趣。其中，酯酶主

2、要發(fā)現(xiàn)于植物、動(dòng)物和微生物中，并且大多數(shù)工業(yè)酯酶都來(lái)源于微生物。同時(shí)，酯酶是非常經(jīng)濟(jì)、高效的生物催化劑，在食品工業(yè)包括營(yíng)養(yǎng)改善、風(fēng)味形成及食品發(fā)酵中有著廣泛應(yīng)用。
　　依靠傳統(tǒng)方法，新的脂肪酶和酯酶是通過(guò)分離產(chǎn)生酯解活性的微生物純培養(yǎng)菌株發(fā)現(xiàn)的。而進(jìn)入基因組時(shí)代，基因組項(xiàng)目使基因挖掘成為可能，利用與已知的脂肪酶和酯酶的同源性，就可搜索新型酯解酶。宏基因組時(shí)代的來(lái)臨更意味著基因組這一領(lǐng)域宏基因組的研究向前邁進(jìn)了一大步，宏基因組即指某

3、一環(huán)境中微生物群落所有基因組的集合。目前，分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以用來(lái)構(gòu)建環(huán)境總DNA庫(kù)，包括不可培養(yǎng)微生物的基因組，這為發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特性質(zhì)的、新穎的未知酶類的廣闊領(lǐng)域打開了一個(gè)新的窗口。另外，可以用宏基因組文庫(kù)進(jìn)行功能篩選，檢測(cè)具有酯解活性的克隆。這種篩選方式的成功依賴于所克隆基因與異源宿主的轉(zhuǎn)錄翻譯元件是否具有兼容性，通常會(huì)選用大腸桿菌作為此類宿主。
　　在本研究中，本實(shí)驗(yàn)室采集來(lái)源于我國(guó)云南栗樹林地區(qū)的土壤樣品，并成功構(gòu)建了一個(gè)

4、高質(zhì)量的宏基因組科斯質(zhì)粒文庫(kù)。通過(guò)利用該文庫(kù)進(jìn)行功能篩選，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新型酯酶EstGX1和EstGX2。多序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析表明，這兩個(gè)預(yù)測(cè)蛋白酶均為微生物脂類水解酶第Ⅳ家族的新成員。聚丙烯酰胺蛋白膠分析表明純化后的EstGX1和EstGX2幾乎顯示為一條帶，它們的分子量大小與預(yù)測(cè)的分子量31kDa和33kDa相一致。隨后，本實(shí)驗(yàn)對(duì)純化酯酶EstGX2的生化特性進(jìn)行分析，處理的相關(guān)酶學(xué)特性包括最適pH、最適溫度以及該酶對(duì)有機(jī)溶劑和金屬