次級代謝產(chǎn)物埃博霉素和頭孢菌素在產(chǎn)生菌中合成的研究.pdf

1、抗生素是與人們?nèi)粘Ｉ钕⑾⑾嚓P(guān)的藥物，自發(fā)現(xiàn)以來挽救了無數(shù)人的生命，一直活躍在臨床治療一線，受到廣泛的重視。對抗生素的研究也在一直進步，藥品不斷更新?lián)Q代，以更好的應(yīng)用于診治患者?？股氐纳a(chǎn)關(guān)系到國計民生，因此對抗生素生產(chǎn)方法的優(yōu)化也就成為科學(xué)研究的重要領(lǐng)域?？股厣a(chǎn)的研究方向主要有兩方面，一是針對藥物種類，開發(fā)新型藥物，二是針對藥物的生產(chǎn)，提高產(chǎn)量及降低成本。優(yōu)化方法主要從兩個方面入手，一是對菌種進行改造，二是對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。本

2、文選取了兩種具有代表性的抗生素進行了研究，一種為新型的抗癌藥物埃博霉素，一種為長期廣泛使用的傳統(tǒng)抗生素頭孢菌素，針對這兩種藥物的生產(chǎn)進行優(yōu)化實驗。
　　本文首次對埃博霉素修飾酶的異源表達菌株進行了檢測，分別檢測了糖基化酶、鹵化酶和酯酶的表達效果，對相應(yīng)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物也進行了檢測。其中糖基化酶和鹵化酶的表達量較高，酯酶的表達量較低。對于含修飾酶菌株進行了發(fā)酵實驗，并對結(jié)果進行檢測，結(jié)果顯示雜質(zhì)較多且由于埃博霉素修飾物產(chǎn)量較低，發(fā)酵體

3、積偏小，未能檢測到修飾物。因此實驗嘗試降低發(fā)酵雜質(zhì)的同時提高埃博霉素的產(chǎn)量。由于酵母浸粉成分復(fù)雜，因此對酵母浸粉對檢測的影響進行了探究，發(fā)現(xiàn)其并非雜質(zhì)的主要來源且對產(chǎn)量也基本無影響。根據(jù)前期纖維堆囊菌So0157-2生產(chǎn)埃博霉素的發(fā)酵實驗結(jié)果，本文通過優(yōu)化發(fā)酵條件，首次對埃博霉素合成基因簇異源表達菌株——ZE系列粘球菌進行小分子添加發(fā)酵實驗，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的化合物以提高產(chǎn)量。分別研究了甲基丙二酸、吲哚乙酸、油酸甲酯和三油酸甘油酯

4、對埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響，根據(jù)本實驗室前期試驗結(jié)果，甲基丙二酸對纖維堆囊菌具有提高產(chǎn)量的效果，而在粘球菌中也具有相同的效果，因此推測其參與了埃博霉素合成的過程。吲哚乙酸對纖維堆囊菌的埃博霉素產(chǎn)生具有促進效果，但在粘球菌中則表現(xiàn)為抑制，推測其參與了纖維堆囊菌特有的代謝途徑。幾種添加物中油酸甲酯對不同的菌株提高產(chǎn)量的功效最強。由于油酸甲酯和三油酸甘油酯在培養(yǎng)初期添加對菌體生長具有一定的抑制效果，因此對添加油酸甲酯和三油酸甘油酯的添加時間進行

5、了探索，最終確定在36小時添加埃博霉素總產(chǎn)量最高，為13.45 mg/L，與在0小時添加油酸甲酯相比埃博霉素總產(chǎn)量提高29.45％。在24時處對添加油酸甲酯的量進行了梯度實驗，添加20μL/mL油酸甲酯產(chǎn)量最高，約為15.97 mg/L，較0小時添加10μL/mL油酸甲酯相比提高了53.71％。為后期確定最佳生產(chǎn)菌株和研究埃博霉素的合成機制提供研究基礎(chǔ)。
　　對于傳統(tǒng)的頭孢菌素生產(chǎn)菌株頂頭孢霉（Acremonium chrysog

6、enum），本文主要對其菌種改造方法進行優(yōu)化。從菌體培養(yǎng)、原生質(zhì)體制備及再生和轉(zhuǎn)化幾方面進行優(yōu)化實驗。最終確定孢子培養(yǎng)的最優(yōu)條件為使用預(yù)先干燥的斜面培養(yǎng)13天。菌絲培養(yǎng)的最優(yōu)方案為使用打碎的孢子懸液過濾液接種SGY液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時。原生質(zhì)體制備使用0.02 g/mL蝸牛酶，酶解時間為1.5小時。原生質(zhì)體再生使用SGY固體培養(yǎng)基進行涂布培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化方面嘗試使用了不同的載體和濃度，但獲得菌株為假陽性，篩選條件需進一步摸索。培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化