牛乳酪蛋白胃腸水解多肽檢測及其CacO-2細胞吸收模型建立.pdf

1、酪蛋白占牛乳蛋白質總質量的80％，是人體重要的營養(yǎng)來源，并表現(xiàn)出一定的生理調節(jié)作用。研究表明，在體外對酪蛋白進行酶水解后能產(chǎn)生一系列有活性的肽段如抗氧化肽、ACE抑制肽、阿片肽等，但酪蛋白在生理環(huán)境內被消化是否能產(chǎn)生類似的具有生理活性肽段，以及這些肽段在體內是否能被完整吸收并發(fā)揮相應的生理作用還有待研究。
　　本研究對牛乳酪蛋白進行體外模擬胃腸消化水解，分析水解物的水解度及抗氧化和抗菌活性，并通過SDS-PAGE、Tricine-

2、SDS-PAGE、CE、RP-HPLC檢測水解物中多肽分子分布狀態(tài)，再輔以動物胃腸消化酪蛋白驗證其消化降解情況。建立Caco-2細胞的培養(yǎng)體系以評價其對腸細胞生長的影響，并采用Transwell板單層膜細胞吸收模型進行酪蛋白水解物的過膜吸收，以確定可被吸收的多肽特征。主要結果如下:
　　(1)體外模擬胃腸消化水解研究。隨著酪蛋白水解時間變長，水解物中游離氨基的含量和水解度逐漸增加，增加的速率下降。游離氨基含量變化表明，胃腸聯(lián)合水解

3、程度＞腸水解＞胃水解。胃水解5h時，水解度為12.9％，胃腸聯(lián)合水解，水解度最終達到72％左右。酪蛋白水解液的DPPH自由基清除率，1h時為29.2％，2h時達到最大值46.4％，2h后逐漸降低，5h時降至34.4％。酪蛋白水解液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都具有抑制作用，且對前者的抑制效果明顯強于后者，抑菌圈直徑分別為36.7 mm和19.5 mm，其中水解2h時，水解液抑菌效果最好。
　　(2)通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過

4、模擬胃液5h的水解，溶液中主要分子量分布由24～26 kDa降到17 kDa以下。通過Tricine-SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，再經(jīng)過腸液5h的水解，溶液中分子量主要分布于7 kDa左右，分子量3.5kDa條帶清晰可見。CE、RP-HPLC分析結果均出現(xiàn)單一峰，峰形良好并無拖尾現(xiàn)象。不同水解時間的CE分析表明，酪蛋白被逐步分解為小分子肽和游離氨基酸。RP-HPLC分析結果則顯示了水解物中肽段隨水解進行，親疏水性發(fā)生了改變，并表明強疏水或

5、親水的肽段能被優(yōu)先消化水解，親水性的多肽增加，而小分子親水性的多肽能夠保持更多肽鏈不受腸消化的破壞。通過體內體外消化水解物的CE和RP-HPLC分析對比，證明模擬體外胃腸水解的方法無論從保留時間、分子大小還是親疏水性上，都有著一定的相似性，計算機輔助相似性評價系統(tǒng)選定標志性差異峰形和普通峰性自動匹配，分析其相似度都在80％以上，本研究所模擬的胃腸環(huán)境可以達到實驗要求。
　　(3)建立Caco-2細胞單層膜模型。當以細胞密度1×10

6、5 cells/mL接種25cm2細胞培養(yǎng)瓶，細胞傳代周期為4-5天，傳代比為1∶3，消化4min，此時細胞成團狀分布但貼壁繁殖速率較快。通過21d的培養(yǎng)，顯微鏡觀察Transwell板上Caco-2細胞單層膜生成狀態(tài)，與空白圖對比，細胞膜致密，無明顯斷裂。TEER測定結果可知，21d時的TEER值為1579Ω·cm2，已經(jīng)超過最低限度500Ω·cm2。檢測標志物熒光黃過膜量，通過熒光黃強度標準曲線和Papp公式計算，得到該膜的Papp

7、值為0.27×10-6crn/s，小于0.5×10-6cm/s，且平均透過率為0.37％。三個通透性指標均達到過膜實驗要求，所建Caco-2單層膜致密、完整。
　　(4)水解物的Caco-2細胞膜吸收。通過檢測CE及RP-HPLC檢測細胞膜頂側和基底側多肽譜圖來完成。CE結果顯示，14min前6 kDa以下的小分子多肽，能被成功吸收進入單細胞層下側，小分子的多肽、氨基酸等更容易被快速吸收。RP-HPLC結果顯示，親或疏水性的多肽都