高產(chǎn)油脂和類胡蘿卜素紅酵母的選育.pdf

1、目前，隨著人口的不斷增長(zhǎng)，油脂需求量日益增加，動(dòng)植物油脂已經(jīng)不能滿足人類的需要。微生物油脂是繼動(dòng)植物油脂之后的又一油脂新資源，它們大多數(shù)富不飽和脂肪酸，具有促進(jìn)人類健康的重要作用。同時(shí)，它也可以作為生產(chǎn)生物柴油的原料。因此，開發(fā)高產(chǎn)油脂微生物資源在食品保健以及生物柴油生產(chǎn)等方面將具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　類胡蘿卜素作為一類具有重要功能的脂溶性色素，廣泛分布于自然界中，其營(yíng)養(yǎng)豐富，具有抗癌、抗氧化、抗心腦血管疾病等功效，因此，已

2、被廣泛應(yīng)用到食品，飼料、保健品及化妝品等行業(yè)。盡管許多研究者已經(jīng)對(duì)如何提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量進(jìn)行了大量的研究，但是，到目前為止，類胡蘿卜素的產(chǎn)量和質(zhì)量仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的需求。
　　在本研究中，我們從實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌中篩選得到一株油脂產(chǎn)量和類胡蘿卜素產(chǎn)量均較高的菌株KC8，通過(guò)誘變育種以及構(gòu)建基因工程菌等手段分別獲得了油脂產(chǎn)量和類胡蘿卜素產(chǎn)量明顯提高的菌株，并利用所構(gòu)建的基因工程菌研究了添加酮康唑?qū)t酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的影響。主

3、要?jiǎng)?chuàng)新性研究結(jié)果有如下幾方面:
　　(1)以KC8為出發(fā)菌株，經(jīng)ARTP誘變，最終從300株誘變存活菌株中篩選得到高產(chǎn)油脂突變菌株Y3，經(jīng)96 h搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，油脂產(chǎn)量為2.38 g/L。對(duì)菌株Y3的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，菌株在葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源，碳氮比為90∶1，培養(yǎng)基初始pH為6.5時(shí)，在28℃的條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，油脂產(chǎn)量最高達(dá)到了3.96 g/L;GC-MS分析結(jié)果表明，該脂肪酸主要由棕櫚油酸、油酸、亞油酸

4、、硬脂酸、二十碳烯酸和二十四烷酸組成，與植物油成分相似。
　　(2)以KC8為出發(fā)菌株，依次經(jīng)ARTP誘變、亞硝酸鈉誘變、紫外誘變、紫外-亞硝酸鈉復(fù)合誘變。最終從800株誘變存活菌株中篩選得到高產(chǎn)類胡蘿卜素突變菌株K4，產(chǎn)量為14.47 mg/L，為出發(fā)菌株的1.67倍，高效液相色譜(HPLC)分析表明，該菌株所產(chǎn)類胡蘿卜素的主要成分為β-胡蘿卜素。
　　(3)以KC8誘變獲得的高產(chǎn)菌株K4為基礎(chǔ)通過(guò)導(dǎo)入并過(guò)表達(dá)類胡蘿卜素合

5、成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因（HMG CoA還原酶）獲得了產(chǎn)量進(jìn)一步提高的基因工程修飾菌株G1。重組酵母G1的類胡蘿卜素產(chǎn)量最高達(dá)到17.02 mg/L，相比誘變后的紅酵母K4產(chǎn)量又提高了17.9％。本研究有別于常規(guī)的在遺傳信息明確的菌株中導(dǎo)入類胡蘿卜素合成基因，而是在野生菌株K4中通過(guò)過(guò)表達(dá)HMG CoA還原酶基因，增加類胡蘿卜素前體物IPP（異戊烯焦磷酸）的合成量，進(jìn)而提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量。首先從釀酒酵母基因組中擴(kuò)增得到1596 bp HM

6、G CoA基因片段，從膠紅酵母KC8基因組擴(kuò)增得到2段具有不同酶切位點(diǎn)的663 bp5.8S-ITS rDNA序列。以來(lái)自質(zhì)粒p416 GPD的強(qiáng)啟動(dòng)子GPD為啟動(dòng)元件，博來(lái)霉素抗性為篩選標(biāo)記，以擴(kuò)增得到的兩段rDNA作為同源整合位點(diǎn)，HMG CoA片段為要表達(dá)的目的基因，成功構(gòu)建了膠紅酵母整合性重組表達(dá)載體pPIC-2rDNA-G-H-C。然后通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入紅酵母K4中，篩選得到一株高產(chǎn)色素的轉(zhuǎn)化株G1。