鹽酸戊乙奎醚對(duì)腦損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 腦卒中是當(dāng)今世界上最重要的致死性疾病之一，中國(guó)人群腦卒中發(fā)病率、死亡率在總死亡中所占比例，城市為20％，農(nóng)村為19％。而在腦卒中中，缺血性中風(fēng)占80％以上。臨床上處理腦缺血性損傷的原則是盡早恢復(fù)血液再灌注，然而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)缺血區(qū)的血供后，在一定程度上反而更加重了缺血性腦損傷，使腦細(xì)胞死亡數(shù)量進(jìn)一步增加，加重病情，這種血流再通后引起的繼發(fā)性損傷稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperf

2、usion injury CIRI)，腦缺血再灌注損傷的存在使腦組織的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷更嚴(yán)重，死亡率更高，大大降低了治療效果，引起世人的廣泛關(guān)注，成為近年來(lái)腦缺血研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　 腦缺血再灌注損傷是一復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其具體機(jī)制目前尚不完全清楚。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腦血流中斷和再灌注使腦的細(xì)胞產(chǎn)生損傷是一個(gè)快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括許多環(huán)節(jié)，如能量障礙、氧自由基的大量釋放、細(xì)胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細(xì)胞內(nèi)鈣

3、失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激活等。這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此重疊，并相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。本文旨在通過(guò)理論、實(shí)驗(yàn)、臨床諸方面研究，以探討鹽酸戊乙奎醚對(duì)大鼠局灶性腦缺血模型神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)與機(jī)制，為防治缺血性腦病更為深入的醫(yī)藥研究提供理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 采用實(shí)驗(yàn)手段，探討鹽酸戊乙奎醚對(duì)大鼠局灶性腦缺血模型神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制。在復(fù)制大鼠局灶性腦缺血病理模型的基礎(chǔ)上，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物S

4、D大鼠(250g～300g)，分為假手術(shù)組、模型組、鹽酸戊乙奎醚高劑量組、鹽酸戊乙奎醚中劑量組、鹽酸戊乙奎醚低劑量組、東莨菪堿組。假手術(shù)組:僅分離右側(cè)大腦中動(dòng)脈不夾閉;模型組:腦缺血再灌注前后不行任何治療措施;鹽酸戊乙奎醚低劑量組:在缺血前20min ip鹽酸戊乙奎醚0.026mg/kg;鹽酸戊乙奎醚中劑量組:在缺血前20min ip鹽酸戊乙奎醚0.08mg/kg;鹽酸戊乙奎醚高劑量組:在缺血前20minip鹽酸戊乙奎醚0.24mg/k

5、g;東莨菪堿(Sco)組:在缺血前20min ip東莨菪堿0.1mg/kg，大鼠缺血再灌注24h后作相應(yīng)處理，取樣本，進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用光鏡與電鏡觀察各組腦組織神經(jīng)細(xì)胞損害情況，通過(guò)比較各組腦梗塞體積，探討鹽酸戊乙奎醚對(duì)局灶性腦缺血神經(jīng)元損傷的保護(hù)效應(yīng);通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各組神經(jīng)元TUNEL染色及Bcl-2、Caspase-3免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，探討鹽酸戊乙奎醚對(duì)大鼠局灶性腦缺血神經(jīng)元凋亡及其相關(guān)基因表達(dá)的影響;對(duì)各組氧自由

6、基相關(guān)物進(jìn)行檢測(cè)，其中SOD檢測(cè)用黃嘌呤氧化酶法，MDA檢測(cè)用TBA顯色法，探討鹽酸戊乙奎醚對(duì)大鼠局灶性腦缺血腦組織中氧自由基的影響;用氨基酸分析儀測(cè)定各組興奮性氨基酸的含量，探討鹽酸戊乙奎醚對(duì)大鼠局灶性腦缺血腦組織中興奮性氨基酸的影響。
　　 選取1日齡Wistar新生大鼠，雌雄不限，75％乙醇消毒后，剝離頭皮及顱骨，取出完整腦組織，鈍性分離海馬，原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元。根據(jù)再灌注不同時(shí)間(1h，6h，12h，24h)及藥物不

7、同濃度(1.6μmol· L-1，0.4μmol·L-1，0.1μmol·L-1)將神經(jīng)元隨機(jī)分4大組:①正常對(duì)照組:正常換液培養(yǎng)。②低糖低氧再灌注損傷組:換以無(wú)糖Hank’s液后置于缺氧盒中，并向內(nèi)通入100％N2作用2h后，換以完全培養(yǎng)基模擬體內(nèi)缺血再灌注的過(guò)程。③藥物處理組:換以無(wú)糖Hank’s液以后分別加入低、中、高三個(gè)濃度的鹽酸戊乙奎醚，其他處理同②組。④MK-801對(duì)照組:換以無(wú)糖Hank's液以后加入MK-801，其他處理

8、同②組。每組細(xì)胞均在倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察低糖低氧再灌注不同時(shí)間一般形態(tài)學(xué)變化，RT-PCR半定量檢測(cè)NMDA受體NR1亞基mRNA的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)選用大鼠的海馬神經(jīng)元作為研究對(duì)象，建立缺糖缺氧再灌注模型，RT-PCR法測(cè)定缺糖缺氧再灌注海馬神經(jīng)元NMDA受體NR1亞基mRNA表達(dá)，探討鹽酸戊乙奎醚對(duì)缺糖缺氧大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 光鏡下可見模型組空泡形成明顯，部分神經(jīng)元周圍間隙擴(kuò)大，

9、神經(jīng)細(xì)胞死亡多，殘存細(xì)胞少，鹽酸戊乙奎醚組神經(jīng)細(xì)胞較為致密，胞漿濃縮較輕，神經(jīng)細(xì)胞死亡減少;對(duì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，壞死與凋亡兩種細(xì)胞死亡形態(tài)均出現(xiàn)，鹽酸戊乙奎醚組細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整;與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組腦梗塞體積顯著減小(P＜0.05);與假手術(shù)組對(duì)比，模型組腦組織TUNEL染色、Caspase-3免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高(P＜0.001)，Bcl-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)下降(P＜0.001);與模

10、型組對(duì)比，鹽酸戊乙奎醚組降低腦組織TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與Caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，增加Bcl-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P＜0.001);鹽酸戊乙奎醚能提高缺血后腦組織中SOD活性并降低MDA含量;與假手術(shù)組對(duì)比，模型組腦組織Glu、Asp、Gly、 GABA含量升高(Pglu=0.012，Pasp＜0.001，Pgly＜0.001，PGABA=0.003)，與模型組對(duì)比，鹽酸戊乙奎醚三個(gè)劑量組均可降低腦組織Glu、Asp、

11、Gly含量(P＜0.05)，鹽酸戊乙奎醚三劑量組能降低腦組織GABA含量，但差異無(wú)顯著性。RT-PCR結(jié)果顯示除缺糖缺氧再灌注1h組各藥物作用不明顯，鹽酸戊乙奎醚低、中、高濃度及MK-801在其他再灌注時(shí)間點(diǎn)均降低NR1亞基mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、鹽酸戊乙奎醚減輕大鼠局灶性腦缺血模型神經(jīng)細(xì)胞的損害，對(duì)腦缺血神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)效應(yīng)。
　　 2、鹽酸戊乙奎醚能通過(guò)影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)抗大鼠局灶性腦缺

12、血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡變化，從而產(chǎn)生對(duì)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 3、鹽酸戊乙奎醚能調(diào)控缺血后腦組織中SOD活性與MDA含量，從而減弱自由基的毒性反應(yīng)。
　　 4、鹽酸戊乙奎醚可調(diào)控缺血后腦組織中興奮性氨基酸含量，拮抗興奮性氨基酸的毒性反應(yīng)，從而起到對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 5、鹽酸戊乙奎醚減少NMDA受體NR1亞基mRNA的表達(dá)，鹽酸戊乙奎醚可能通過(guò)作用于NMDA受體減輕海馬神經(jīng)元缺血缺氧再灌注損傷發(fā)揮