LncRNA TCONS_00179042對PRRSV在Marc--145細(xì)胞中復(fù)制的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)已發(fā)現(xiàn)30多年，但至今沒有非常有效的防控措施。2006年我國出現(xiàn)了PRRS高致病性毒株（Highly pathogenicporcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV），并逐漸發(fā)展成為流行的優(yōu)勢毒株，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

2、　　長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)存在于多種生物體內(nèi)，在各類細(xì)胞中廣譜表達(dá)，作為RNA調(diào)節(jié)因子在基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多方面發(fā)揮重要作用，并通過形成免疫復(fù)合物發(fā)揮抗病毒固有免疫功能。
　　本實驗室通過前期高通量轉(zhuǎn)錄本測序研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophage，PAM)后，LncRNA TCONS_00179042的表達(dá)量顯著低于正常P

3、AM細(xì)胞中。因此，為了驗證該LncRNA在病毒感染過程中的作用，首先采用RT-PCR克隆獲得LncRNATCONS_00179042基因序列，并使用生物信息學(xué)方法進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析;然后構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA31-TCONS_00179042轉(zhuǎn)染猴胚胎腎上皮細(xì)胞(Monkey embryonickidney epithelial cell,Marc-145)，通過qPCR、Western blotting以及TCID50檢測，分析該

4、LncRNA過表達(dá)對PRRSVGSWW15病毒復(fù)制的影響;通過核質(zhì)組分分離試驗對PAM細(xì)胞中LncRNA TCONS_00179042進(jìn)行半定量分析;最后通過細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)預(yù)測分析方法對LncRNATCONS_00179042的靶基因進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，LncRNA TCONS_00179042轉(zhuǎn)錄本長度約為430nt,具有比較復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)。LncRNA TCONS_00179042過表達(dá)后，qPCR結(jié)果顯示該Lnc

5、RNA的相對表達(dá)量約是對照組的3×105倍，表明LncRNA TCONS_00179042能在Marc-145細(xì)胞中過表達(dá)。利用PRRSV GSWW15株感染過表達(dá)LncRNA TCONS_00179042的Marc-145細(xì)胞后，通過qPCR檢測顯示過表達(dá)LncRNA組PRRSV RNA拷貝數(shù)約為對照組的60％;通過Western blotting檢測顯示過表達(dá)LncRNA組PRRSV N蛋白表達(dá)豐度約為對照組的25％;通過病毒TCI

6、D50檢測顯示過表達(dá)LncRNA組PRRSV病毒滴度顯著低于對照組。三組數(shù)據(jù)均顯示，LncRNATCONS_00179042過表達(dá)后能顯著抑制PRRSV GSWW15在Marc-145細(xì)胞中的復(fù)制，具有明顯的抗病毒功能。核質(zhì)分離試驗結(jié)果顯示細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有LncRNA TCONS_00179042存在，且細(xì)胞核中的表達(dá)水平高于細(xì)胞質(zhì)中。PRRSV感染過表達(dá)LncRNATCONS_00179042的Marc-145細(xì)胞后，細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄