SCF-c-kit信號(hào)途徑通過GRK6轉(zhuǎn)激活CXCR4并調(diào)控心臟干細(xì)胞的遷移.pdf

1、大量的研究表明，在正常成年人和鼠心臟內(nèi)含有原始的、未分化的Lin(-) c-kit(+)干細(xì)胞，它們分布廣泛并維持著心臟內(nèi)部的穩(wěn)態(tài)，被認(rèn)為是心臟干細(xì)胞(Cardiac stem cell, CSC)。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌梗死模型中，受損心肌細(xì)胞高度表達(dá)干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF)，SCF及其位于 CSC表面的受體 c-kit構(gòu)成的SCF/c-kit信號(hào)介導(dǎo)了 CSC向梗死區(qū)的遷移并改善了心功能。在實(shí)

2、驗(yàn)過程中，我們?cè)噲D通過阻斷 SCF/c-kit的下游信號(hào) p38 MAPK來阻斷CSC的遷移，但出人意料的是，阻斷 p38 MAPK并未能完全阻斷 CSC的遷移，提示可能還有其他信號(hào)因子發(fā)揮了調(diào)控CSC遷移的作用。CSC除了表達(dá)c-kit之外，還表達(dá)另外一個(gè)與趨化相關(guān)的受體 CXCR4。有報(bào)道稱，CXCR4在沒有其配體基質(zhì)衍生因子1（SDF-1）存在的情況下，仍然可以被其它的受體信號(hào)轉(zhuǎn)激活，從而發(fā)揮作用。但是 SCF/c-kit信號(hào)是否

3、能夠轉(zhuǎn)激活 CXCR4，從而影響細(xì)胞的遷移呢？這一點(diǎn)并不清楚。本研究旨在探討CXCR4轉(zhuǎn)激活在SCF/c-kit誘導(dǎo)的CSC遷移中的作用及機(jī)制，論文分為3個(gè)部分：
　　第一部分：心臟干細(xì)胞的培養(yǎng)分離和鑒定。利用原代組織塊培養(yǎng)的技術(shù)，從C57BL/6小鼠心臟中分離出 c-kit陽性的心臟干細(xì)胞，并在體外予以擴(kuò)增培養(yǎng)。通過流式細(xì)胞儀和免疫熒光的檢測(cè)，CSC為c-kit和CXCR4雙陽性細(xì)胞，并且長期的體外培養(yǎng)也基本不影響c-kit和C

4、XCR4的表達(dá)，說明可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。另外，分離出的CSC在體外用地塞米松進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，CSC可以成功的向心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化，說明CSC具有多向分化的潛能。
　　第二部分：CXCR4的轉(zhuǎn)激活在SCF/c-kit信號(hào)誘導(dǎo)的CSC遷移中的作用。首先，我們用SCF刺激CSC，通過Transwell和Western Blotting的方法來觀察SCF/c-kit信號(hào)激活后對(duì)CSC遷移及與遷移相關(guān)MAPK信號(hào)的影響。然后用

5、CXCR4的siRNA沉默CSC中CXCR4的表達(dá)，觀察CSC的遷移在沉默CXCR4之后的改變。已只CXCR4激活后可引起起絲氨酸339位點(diǎn)的磷酸化，于是，我們用SCF刺激CSC，觀察SCF/c-kit信號(hào)是否能夠轉(zhuǎn)激活CXCR4，并引起其絲氨酸339位點(diǎn)磷酸化的變化。接下來，我們構(gòu)建CXCR4絲氨酸339位點(diǎn)缺失突變的模型，研究CXCR4絲氨酸339位點(diǎn)的缺失對(duì)SCF/c-kit信號(hào)的影響。結(jié)果顯示：SCF能夠誘導(dǎo)CSC的遷移以及增強(qiáng)

6、CXCR4絲氨酸339位點(diǎn)、p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化。沉默CXCR4之后后，SCF/c-kit信號(hào)引起的CSC的遷移、p38 MAPK及ERK1/2的磷酸化也隨之降低。在HEK293細(xì)胞系中，CXCR4絲氨酸339位點(diǎn)的缺失也會(huì)影響SCF/c-kit信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。
　　第三部分：G protein-coupled receptor kinase6（G蛋白受體激酶6，GRK6）調(diào)控CXCR4絲氨酸339位點(diǎn)的磷酸

7、化并影響SCF/c-kit信號(hào)介導(dǎo)的CSC的遷移。根據(jù)報(bào)道，GRK6在 CXCR4磷酸化的過程中起到了重要的作用，所以我們用 GRK6的質(zhì)?；騭iRNA使CSC中GRK6的表達(dá)量升高或降低，來觀察其在SCF/c-kit信號(hào)中是否會(huì)影響CXCR4絲氨酸339位點(diǎn)的磷酸化以及細(xì)胞的遷移。之后我們?cè)隗w內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在小鼠的心肌梗死模型中，我們沉默GRK6之后觀察CSC向梗死區(qū)遷移量的改變。結(jié)果顯示：沉默GRK6減弱SCF/c-kit誘導(dǎo)的C

8、XCR4絲氨酸的磷酸化、CSC的遷移以及MAPK的激活；而高表達(dá)GRK6則是相反的結(jié)果。另外，在小鼠心肌梗死模型中，沉默GRK6也影響CSC向梗死區(qū)遷移的能力。
　　綜上所述，c-kit和CXCR4在CSC中存在信號(hào)和功能上的交流。SCF/c-kit信號(hào)通過GRK6能夠轉(zhuǎn)激活CXCR4，并且誘導(dǎo)其絲氨酸339位點(diǎn)的磷酸化，共同調(diào)節(jié)CSC的遷移和下游信號(hào)MAPK的激活。c-kit和CXCR4這兩個(gè)受體信號(hào)通路都和CSC參與心肌修復(fù)有